חֲדָשׁוֹת

אסטרטגיות אבחון מסורתיות לאיתור מחלות זיהומיות דורשות שימוש במכשירים משטחים שאינם מתאימים לבדיקת נקודת טיפול (POCT).Emerging microfluidics היא טכנולוגיה ממוזערת, אוטומטית ומשולבת ביותר המהווה אלטרנטיבה פוטנציאלית לשיטות מסורתיות לאבחון מהיר, זול ומדויק באתר.שיטות אבחון מולקולריות נמצאות בשימוש נרחב במכשירים מיקרופלואידיים כשיטות היעילות ביותר לזיהוי פתוגנים.סקירה זו מסכמת את ההתקדמות האחרונה באבחון מולקולרי מבוסס מיקרו-נוזלים של מחלות זיהומיות מנקודת מבט אקדמית ותעשייתית כאחד.ראשית, אנו מתארים עיבוד אופייני בשבב של חומצות גרעין, כולל טיפול מקדים בדגימה, הגברה וקריאת אותות.לאחר מכן משווים את המאפיינים, היתרונות והחסרונות של ארבעת סוגי הפלטפורמות המיקרופלואידיות.לאחר מכן, נדון בשימוש במבחנים דיגיטליים לכימות מוחלטת של חומצות גרעין.מכשירי אבחון מולקולריים מבוססי מיקרו-נוזלים מסחריים קלאסיים וגם עדכניים מסוכמים כראיה למצב הנוכחי של השוק.לבסוף, אנו מציעים כיוונים עתידיים לאבחון מיקרופלואידי של מחלות זיהומיות.
מחלות זיהומיות נגרמות על ידי פתוגנים, כולל חיידקים, וירוסים וטפילים, המופצים ברחבי העולם.בניגוד למחלות אחרות, פתוגנים נדבקים במהירות ומתפשטים בין בני אדם ובעלי חיים מארחים באמצעות חיסון, אוויר ומים [1].מניעת מחלות זיהומיות היא קריטית כאמצעי בריאות הציבור.שלוש אסטרטגיות עיקריות למלחמה במחלות זיהומיות: (1) שליטה במקור הזיהום;(2) הפסקת נתיב השידור;(3) הגנה על אוכלוסיות רגישות.בין האסטרטגיות העיקריות, השליטה במקור ההדבקה נחשבת לאסטרטגיה החשובה ביותר בשל נוחותה ועלותה הנמוכה.אבחון מהיר, בידוד וטיפול באנשים נגועים הם קריטיים, הדורשים אסטרטגיות אבחון מהירות, רגישות ומדויקות [2].האבחנה הנוכחית של מחלות זיהומיות משלבת בדרך כלל בדיקה קלינית המבוססת על סימנים ותסמינים ומחקרי מעבדה כגון תרבית תאים ואבחון מולקולרי, הדורשים צוות מיומן, הליכים עתירי עבודה וציוד בדיקה יקר [3, 4].מניעת התפרצויות מחלות זיהומיות מחייבת אבחון מקומי מהיר, זול ומדויק, במיוחד באזורים מוגבלי משאבים בהם מחלות זיהומיות שכיחות וקשות [5], וכן טיפול במדבר או בשדה הקרב, בהם מצבי חירום אינם ניתנים לחיזוי..הטיפול הרפואי מוגבל [6].בהקשר זה, מיקרופלואידיקה היא טכנולוגיה המשלבת טכנולוגיות מערכות מיקרו-אלקטרו-מכאניות, ננוטכנולוגיה או מדעי החומרים למניפולציה מדויקת של נוזלים [7,8,9,10], המספקת אפשרויות חדשות לזיהוי נקודת טיפול (POCT).) גורמים זיהומיים מחוץ לבתי חולים ומעבדות.בהשוואה לאבחון מסורתי הדורש זמן, טכנולוגיית מיקרופלואידית מציעה חיסכון בדגימות ובעלויות לאבחון מולקולרי במהלך התפרצויות מחלות.ההתפשטות העולמית של מחלת נגיף הקורונה 2019 (COVID-19) נגרמת על ידי תסמונת נשימתית חריפה נגיף קורונה 2 (SARS-CoV-2), כך שחשיבותם של מיקרופלואידים למניעה ובקרה בזמן של המגיפה מודגשת שוב [11, 12 , 13].שלא כמו אבחון מסורתי, POCT מיקרופלואידי משתמש במכשירים ניידים קטנים, החל מנתחי שולחן ועד רצועות בדיקה קטנות של זרם צד לבדיקה ליד נקודת הדגימה [14].בדיקות אלו כוללות הכנת דגימה פשטנית או לא, הגברה מהירה של אותות וקריאת אותות רגישים וכתוצאה מכך משך זמן קצר ותוצאות מדויקות בתוך דקות.הזמינות והייצור ההמוני של מכשירי בריאות מבוססי מיקרו-נוזל הרחיבו את יישומי האבחון החסכוניים והישירים שלהם מחוץ לבית החולים, ליד המטופל ואפילו בבית.
מבין האסטרטגיות הקיימות לאבחון מחלות זיהומיות, האבחון המולקולרי הוא אחד הרגישים ביותר [15, 16].בנוסף, אבחון מולקולרי משמש לעתים קרובות כסטנדרט הזהב לזיהוי מתמשך של COVID-19, המאפשר זיהוי ישיר של אזורים ספציפיים לווירוסים של RNA או DNA לפני תחילתה של תגובה חיסונית [17, 18].בסקירה הנוכחית, אנו מציגים את ההתקדמות העדכנית ביותר בתהליכי אבחון מולקולריים המבוססים על מיקרופלואידים למחלות זיהומיות, מנקודת מבט אקדמית לנקודות מבט תעשייתיות עתידיות (איור 1).נתחיל בשלושה שלבים מרכזיים בזיהוי חומצות גרעין: טיפול מקדים בדגימה על השבב, הגברה של חומצת גרעין וקריאת אותות.לאחר מכן השווינו סוגים שונים של פלטפורמות מיקרופלואידיות עם המבנה והתפקוד שלהן, תוך הצגת מאפיינים ייחודיים (חוזקות וחולשות).גילוי חומצות גרעין דיגיטליות נדון בהמשך וניתן כדוגמה לטכנולוגיית דור שלישי לכימות מוחלטת של מולקולות פתוגנים זיהומיות.בנוסף, יוצגו מספר מכשירי POCT מסחריים טיפוסיים ועדכניים ביותר כדי להדגים את המצב הנוכחי של שוק ה-POCT המיקרופלואידי לאבחון מולקולרי.כמו כן, נדון ונסביר את החזון שלנו ליישומים עתידיים.
ניתן לחלק מודולים של שבבים מיקרופלואידיים לזיהוי חומצות גרעין לשלוש קטגוריות (דגימה, זיהוי ואיתות) על פי תפקידיהם [19].בין המודולים הללו, מודול הדגימה מממש בעיקר תמוגה של דגימה ומיצוי חומצת גרעין.מודול החיישן שולט בעיקר על ההמרה וההגברה של אותות חומצת גרעין.מודול האיתות מזהה את האות שהומר ומעובד על ידי מודול החישה.בהתבסס על תהליך זיהוי חומצות גרעין בשבב, נסכם את השבבים השונים שיכולים לממש את פונקציית "הקלט והפלט".
השלב הראשון בזיהוי חומצות גרעין הוא מיצוי חומצת גרעין, כלומר בידוד חומצת הגרעין היעד מהדגימה המקורית.מיצוי חומצת גרעין מבוצעת כדי לטהר חומצות גרעין ממזהמים מולקולריים אחרים, להבטיח את שלמות המבנה הראשוני של מולקולות חומצת גרעין ולייעל את התוצאות.מיצוי חומצת גרעין דורש תמוגה של דגימה ולכידת חומצת גרעין הדרושה, שלאיכותם ויעילותם יש השפעה עצומה על תוצאות המחקר והאבחון.כל תופעות לוואי עדינות במהלך החילוץ עשויות להגביל גילוי נוסף.לדוגמה, שיטות תגובת שרשרת פולימראז (PCR) ושיטות הגברה איזותרמית בלולאה (LAMP) מעוכבות על ידי כמה ממסים אורגניים שיוריים כגון אתנול ואיזופרופנול בריאגנטים לבידוד חומצות גרעין [20].מיצוי נוזל-נוזל ומיצוי שלב מוצק הן השיטות הפופולריות ביותר לבידוד חומצות גרעין [21], אולם מיצוי נוזל-נוזל על שבב מוגבל ביותר, מכיוון שהריאגנטים המשמשים למיצוי נוזל-נוזל גורמים לקורוזיה של רוב השבבים המיקרו-נוזליים. .כאן, אנו מדגישים שיטות מיצוי פאזה מוצקה מבוססות מיקרו-מערך ומשווים את היתרונות והחסרונות שלהן.
סיליקון הוא חומר מצע התואם לחומצות גרעין בשל תאימותו הביולוגית, יציבותו וקלות השינוי שלו [22].חשוב לציין, כאשר משתנה עם סיליקה או חומרים אחרים, חומר מרוכב זה מפגין תכונות לספוח חומצות גרעין טעונות שלילי בתנאי pH נמוך ומלח גבוה תוך פליטה עם pH גבוה, תמיסות מלח נמוכות.על סמך תופעה זו ניתן לטהר את חומצת הגרעין.
צורות שונות של חומרים מבוססי סיליקה שימשו למיצוי חומצת גרעין במיקרו-נוזלים, כגון חרוזי סיליקה, אבקות, מסנני מיקרופייבר וממברנות סיליקה [23, 24, 25, 26].בהתאם לתכונות החומר, ניתן להשתמש בחומרים על בסיס סיליקון במעגלים מיקרו בדרכים שונות.לדוגמה, גרגירי סיליקה, אבקות וננו-פילטרים מסחריים יכולים פשוט להיות ממוקמים לתוך הנקבוביות או המיקרו-תעלות של שבבים מיקרופלואידיים ולעזור לחלץ חומצות גרעין מדגימות [27, 28, 29].ניתן להשתמש בממברנות סיליקה שעברו שינוי פני השטח גם כדי לטהר במהירות DNA מפתוגנים בעלות נמוכה.לדוגמה, Wang et al.[30] על ידי שילוב של תגובות הגברה דנטורטיביות עם חילופי שרשרת בתיווך שלפוחית ​​עם קרומי סיליקה מצופים באוליגוסכרידים של צ'יטוסן, הוכנסה מערכת ניידת רב-תכליתית שזיהתה בהצלחה 102-108 יחידות יוצרות מושבות.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus., ונוכחות הנגיף נראתה בקלות.פאוול וחב'.[31] לאחר מכן נעשה שימוש במיקרו-מערכים מבוססי סיליקון לזיהוי וירוס הפטיטיס C (HCV), וירוס כשל חיסוני אנושי (HIV), וירוס זיקה, וירוס פפילומה אנושי והתפשטות אוטומטית, שבהם פותח מיקרו-כור מתפתל בנפח 1.3 μl ללכידת נגיפי RNA.ולבצע הגברה במקום.בנוסף לשיטות אלו, מיקרו-עמודות סיליקה שעברו שינוי פני השטח ממלאות גם תפקיד מפתח במיצוי חומצת גרעין, שכן הגיאומטריה והתכונות של החומר המשתנה מגדילות מאוד את יעילות המיצוי.חן וחב'.[32] הציע פלטפורמה מיקרופלואידית לבידוד של RNA בריכוז נמוך המבוססת על עמודות סיליקון מצופות אמינו.התקן מיקרופלואידי זה משלב מערך של עמודי מיקרו בגודל 0.25 סמ"ר על מצע סיליקון כדי להשיג יעילות מיצוי גבוהה יותר באמצעות עיצוב יחס שטח פנים לנפח גבוה.היתרון של עיצוב זה הוא שהמכשיר המיקרופלואידי יכול להשיג עד 95% יעילות מיצוי חומצת גרעין.אסטרטגיות אלו המבוססות על סיליקון מדגימות את הערך של בידוד מהיר של חומצות גרעין בעלות נמוכה.בשילוב עם שבבים מיקרופלואידיים, אסטרטגיות מיצוי מבוססות סיליקון יכולות לא רק להגביר את היעילות של זיהוי חומצות גרעין, אלא גם להקל על מזעור ואינטגרציה של מכשירים אנליטיים [20].
שיטות הפרדה מגנטית משתמשות בחלקיקים מגנטיים כדי לבודד חומצות גרעין בנוכחות שדה מגנטי חיצוני.חלקיקים מגנטיים בשימוש נפוץ כוללים חלקיקים מגנטיים Fe3O4 או γ-Fe2O3 המצופים בסיליקה, אמינו וקרבוקסיל [33,34,35,36].המאפיין המבחין של חלקיקים מגנטיים בהשוואה לשיטות SPE מבוססות סיליקון הוא קלות המניפולציה והשליטה עם מגנטים חיצוניים.
באמצעות האינטראקציה האלקטרוסטטית בין חומצות גרעין לסיליקה, בתנאים של מלח גבוה ו-pH נמוך, חומצות גרעין נספגות על פני השטח של חלקיקים מגנטיים מצופים סיליקה, בעוד שבתנאים של מלח נמוך ו-pH גבוה, ניתן לשטוף את המולקולות שוב..חרוזים מגנטיים מצופים סיליקה מאפשרים לחלץ DNA מדגימות בנפח גדול (400 μL) באמצעות תנועה מבוקרת מגנטית [37].כהדגמה, רודריגז-Mateos et al.[38] השתמש במגנטים הניתנים לכיוון כדי לשלוט בהעברת חרוזים מגנטיים לחדרים שונים.בהתבסס על חלקיקים מגנטיים מצופים סיליקה, ניתן לחלץ 470 עותקים/מ"ל של RNA גנומי SARS-CoV-2 מדגימות שפכים לזיהוי שעתוק לאחור של LAMP (RT-LAMP) וניתן לקרוא את התגובה תוך שעה.עין בלתי מזוינת (איור 2א).
מכשירים המבוססים על חומרים מגנטיים ונקבוביים.תרשים מושגי של התקן המיקרופלואידי IFAST RT-LAMP לזיהוי RNA SARS-CoV-2 (מותאם מ-[38]).b מכשיר מיקרו צנטריפוגלי ל-dSPE של חומצת גרעין ספוגית (מותאמת מ-[39]).ג רכז מדגם מובנה המופעל באמצעות כרטיס FTA® (מותאם מ-[50]).d פיוז'ן 5 נייר סינון שונה עם chitosan (מותאם מ-[51]).SARS-CoV-2 תסמונת נשימה חריפה חמורה נגיף קורונה 2, RT-LAMP לולאת שעתוק לאחור בתיווך הגברה איזוטרמית, שותפים בטכנולוגיה למצוא FTA, חומצת גרעין NA
חלקיקים מגנטיים בעלי מטען חיובי הם אידיאליים לחיבור עמוד השדרה הפוספט של חומצת גרעין.בריכוז מלח מסוים, קבוצות הפוספט הטעונות שליליות של חומצות גרעין יכולות להיות מטענות חיוביות על פני החלקיקים המרוכבים המגנטיים.לכן פותחו ננו-חלקיקים מגנטיים בעלי משטח מחוספס וצפיפות גבוהה של קבוצות אמינו למיצוי חומצות גרעין.לאחר הפרדה וחסימה מגנטית, ניתן להשתמש ישירות בננו-חלקיקים וקומפלקסים של DNA ב-PCR, מה שמבטל את הצורך בפעולות טיהור ואלוציה מורכבות וגוזלות זמן [35].ננו-חלקיקים מגנטיים המצופים בקבוצות קרבוקסיל שליליות שימשו גם להפרדת חומצות גרעין הנספגות על משטחים בתמיסות פוליאתילן גליקול ונתרן כלורי בריכוז גבוה [36].עם חרוזים מגנטיים שעברו שינוי משטח, מיצוי DNA תואם להגברה שלאחר מכן.דינן וחב'.[39] תיאר פלטפורמה מיקרופלואידית צנטריפוגלית אוטומטית וניידת לטיפול מקדים בחומצות גרעין, המאפשרת לצוות לא טכני להשתמש בה באתר.בנוסף, התאימות של ה-DNA המבודד עם LAMP, שיטה המתאימה היטב לניתוח חומצות גרעין נקודתיות, מדגימה עוד יותר דרישות ציוד מינימליות והתאמה למבחנים קולורימטריים (איור 2ב).
שיטות חרוזים מגנטיים מציעות אפשרות של מיצוי אוטומטי, שחלקן קיימות במחלצי חומצות גרעין אוטומטיות מסחריות [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, ארה"ב), QIAcube® HT;CapitalBio (בייג'ינג, סין) ו-Biomek®;בקמן (מיאמי, ארה"ב).), פלורידה, ארה"ב)].היתרונות של שילוב חרוזים מגנטיים עם מיקרופלואידים יכולים לשמש למיצוי אוטומטי יעיל של חומצות גרעין, מה שעלול לקדם את הפיתוח של אבחון מולקולרי;עם זאת, השילוב של חרוזים מגנטיים עם מיקרופלואידים עדיין מסתמך במידה רבה על מערכות בקרה מורכבות למניפולציה מדויקת של חרוזים מגנטיים, מה שמסביר את הפופולריות של מוצרים מסחריים מגושמים ויקרים, מה שמגביל את היישום הנוסף של חרוזים מגנטיים ב-POCT.
מספר חומרים נקבוביים כגון מסנני ניטרוצלולוזה שונה, כרטיסי Finders Technology Associates (FTA), ניירות סינון מבוססי פוליאתרסולפון וחומרים מצופים בגליקן שימשו גם לזיהוי חומצות גרעין [40, 41, 42, 43, 44].חומרים סיביים נקבוביים כגון נייר סיבי שימשו לראשונה לבידוד DNA על ידי הסתבכות פיזית של מולקולות DNA ארוכות גדיל עם סיבים.נקבוביות קטנות מובילות להגבלה פיזית חזקה של מולקולות DNA, אשר משפיעה באופן חיובי על מיצוי ה-DNA.בשל גדלי הנקבוביות השונים של נייר סיבי, יעילות המיצוי אינה יכולה לענות על הצרכים של הגברה של DNA [45, 46].כרטיס ה-FTA הינו נייר סינון מסחרי המשמש בתחום הרפואה המשפטית ובשימוש נרחב בתחומים נוספים של אבחון מולקולרי.באמצעות שימוש בנייר סינון תאית ספוג בכימיקלים שונים לליזה של קרומי התא בדגימה, ה-DNA המשוחרר מוגן מפני השפלה למשך עד שנתיים.לאחרונה פותח נייר תאית ספוג לזיהוי מולקולרי של פתוגנים שונים, כולל SARS-CoV-2, לישמניאזיס ומלריה [47,48,49].HIV בפלזמה המבודדת עובר ליטוש ישיר, וחומצת הגרעין הוויראלית מועשרת בממברנת הזרימה של FTA® המובנית ברכז, מה שמאפשר ייצור יעיל של חומצת הגרעין [50] (איור 2c).הבעיה העיקרית בזיהוי חומצות גרעין באמצעות כרטיסי FTA היא שכימיקלים כגון גואנידין ואיזופרופנול מעכבים תגובות הגברה עוקבות.כדי לפתור בעיה זו, פיתחנו נייר סינון עם שינויי Chitosan Fusion 5, המשלב את היתרונות של השזירה הפיזית של מולקולות DNA ונייר סינון סיבי, וגם ספיחה אלקטרוסטטית של DNA על תרכובות שעברו שינוי בצ'יטוזן כדי להשיג מיצוי חומצת גרעין יעילה ביותר. ..סיבי סינון [51] (איור 2ד).באופן דומה, Zhu et al.[52] הדגימה שיטת PCR שעברה שינוי בצ'יטוזן המבוססת על מערכת מיקרופלארית נימית במקום לבידוד מהיר וזיהוי של RNA של וירוס זיקה.חומצות גרעין יכולות להיספג/לספוג במדיום lysate/PCR מעורב, בהתאמה, בהתבסס על תכונת מתג ההפעלה/כיבוי של הצ'יטוזן.on and off", מגיב ל-pH.
כפי שהוזכר לעיל, אסטרטגיות אלו משלבות את היתרונות של חומרים שונים בשלב מוצק ומגבירות את היעילות של מיצוי חומצות גרעין במיקרו-נוזליות.ביישומים מעשיים, השימוש בחומרים אלו בכמויות גדולות אינו חסכוני, וטיפול נכון במשטח או שינוי פני השטח של חומרים נפוצים עם חומרים אלו יכולים גם הם לשמר את תפקודם.לכן, מאמינים שיישום אסטרטגיות אלה לאחר מחקר פיילוט יכול להפחית עלויות.
בדיקת חומצות גרעין בפלטפורמות מיקרופלואידיות משתמשות לעתים קרובות בנפחי דגימה קטנים (<100 μl), ולכן דורשת הגברה של חומצות הגרעין היעד עם בדיקות ספציפיות להמרה לאות שנוח לזיהוי במורד הזרם (אופטי, חשמלי ומגנטי) [53, 54]. בדיקת חומצות גרעין בפלטפורמות מיקרופלואידיות משתמשות לעתים קרובות בנפחי דגימה קטנים (<100 μl), ולכן דורשת הגברה של חומצות הגרעין היעד עם בדיקות ספציפיות להמרה לאות שנוח לזיהוי במורד הזרם (אופטי, חשמלי ומגנטי) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. בעת בדיקת חומצות גרעין על פלטפורמות מיקרופלואידיות, נעשה שימוש לעתים קרובות בנפחי דגימות קטנים (<100 μL), ולכן נדרשת הגברה של חומצות גרעין מטרה עם בדיקות מיוחדות כדי להמיר אותה לאות נוח לגילוי עוקב (אופטי, חשמלי ומגנטי) [53, 54].微流控 平台 上 的 核酸 检测 通常 使用 小样本量 （<100 μl Å ].微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 小样本量 （（<100 μl） ， ， 因此 需要 特定 探针 扩增 目标 ， 以 转换 为 下游 （（、 电学 磁学）） 的 信号 [53, 54, 54, 54 ]. Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. זיהוי של חומצות גרעין בפלטפורמות מיקרופלואידיות משתמש בדרך כלל בנפחי דגימה קטנים (<100 μl), מה שמצריך הגברה של חומצות גרעין מטרה עם בדיקות מיוחדות כדי להמיר אותן לאותות לזיהוי מאוחר יותר (אופטי, חשמלי ומגנטי) [53, 54]] .הגברה של חומצות גרעין במיקרו-נוזליות יכולה גם להאיץ תגובות, לייעל את גבולות הזיהוי, להפחית את דרישות הדגימה ולשפר את דיוק הזיהוי [55, 56].בשנים האחרונות, עם מימוש הזיהוי המהיר והמדויק, יושמו שיטות שונות של הגברה של חומצות גרעין במיקרו-נוזליות, כולל PCR וכמה תגובות הגברה איזותרמיות.חלק זה יסכם שיטות לזיהוי חומצות גרעין המבוססות על מערכות מיקרו-נוזליות.
PCR הוא הדמיה של תהליך שכפול ה-DNA של אורגניזם, שהתיאוריה שלו מתוארת בפירוט במקום אחר ולא תידון כאן.PCR יכול להגביר כמות קטנה מאוד של DNA/RNA יעד בקצב אקספוננציאלי, מה שהופך את PCR לכלי רב עוצמה לזיהוי מהיר של חומצות גרעין.בעשורים האחרונים פותחו מכשירים ניידים מיקרופלואידים רבים המצוידים במערכות רכיבה תרמית PCR כדי לענות על הצרכים של אבחון נקודתי [57, 58].ניתן לחלק PCR על-שבב לארבעה סוגים (קונבנציונלי, זרימה רציפה, מיתוג מרחבי ו-PCR הסעה) לפי שיטות בקרת טמפרטורה שונות [59].לדוגמה, Gee et al.[60] פיתחו שיטת PCR כמותית של שעתוק הפוכה (RT-qPCR) בפלטפורמה מיקרופלואידית משלהם לזיהוי מרובה של נגיפי SARS-CoV-2, שפעת A ו-B בדגימות משטח גרון (איור 3א).פארק ואח'.[61] בנה שבב ניתוח פתוגן פשוט על ידי שילוב של PCR סרט דק, אלקטרודות ומודול מיקרופלואידי מבוסס פולידימתיל סילוקסן.עם זאת, שתי העבודות מגלמים את החסרונות הנפוצים של PCR קונבנציונלי.PCR מצריך רכיבה תרמית, מה שמגביל מזעור מכשיר נוסף וצמצום זמן הבדיקה.
הפיתוח של PCR מבוסס זרימה רציפה מיקרופלואידית ומתחלף בחלל הוא קריטי כדי לטפל בבעיה זו.באמצעות תעלת סרפנטין ארוכה או תעלה ישרה קצרה, זרימה רציפה PCR יכולה לספק הגברה מהירה על ידי זרימת ריאגנטים פעילה בשלושה אזורי חימום מראש עם משאבה מחוץ לשבב.פעולה זו מונעת בהצלחה את שלב המעבר בין טמפרטורות תגובה שונות ובכך מפחיתה משמעותית את זמן הבדיקה [62] (איור 3b).במחקר אחר של יונג וחב'.[63] הציע מנתח PCR גנטי סיבובי חדש המשלב את המאפיינים של PCR קבוע וזרימה עבור PCR שעתוק לאחור מהיר ומרובב (איור 3c).להגברת חומצות גרעין, המיקרו-שבב PCR יסובב דרך שלושה בלוקי חימום בטמפרטורות שונות: 1. בלוק דנטורציה 94°C, 2. בלוק חישול ב-58°C, 3. בלוק הרחבה ב-72°C.
יישום של PCR במיקרופלואידיקה.ייצוג סכמטי של dirRT-qPCR על פלטפורמה מיקרופלואידית (מותאם מ-[60]).ב ייצוג סכמטי של מיקרו-מערך PCR זרימה רציפה המבוססת על ערוץ סרפנטין (מותאם מ-[62]).ג ייצוג סכמטי של מנתח PCR גנטי סיבובי, המורכב משבב, שלושה בלוקי חימום ומנוע צעד (מותאם מ-[63]).ד תרשים של PCR תרמו-קונבקציה עם צנטריפוגה והגדרה (מותאם מ-[64]).DirRT-qPCR, תגובת שרשרת של תעתוק הפוך כמותי ישיר של פולימראז
באמצעות נימים ולולאות או אפילו צלחות דקות, PCR הסעה יכול להגביר במהירות חומצות גרעין על ידי הסעה תרמית חופשית טבעית ללא צורך במשאבה חיצונית.לדוגמה, פלטפורמה מיקרופלואידית של פולימר אולפינים מחזורית פותחה על שלב חימום מסתובב מפוברק המשתמש במחזוריות תרמית עם צנטריפוגה במיקרו-ערוץ לולאת PCR [64] (איור 3ד).תמיסת התגובה מונעת על ידי הסעה תרמית, המחליפה ללא הרף טמפרטורה גבוהה ונמוכה במיקרו-תעלה בעלת מבנה טבעתי.ניתן להשלים את כל תהליך ההגברה תוך 10 דקות עם מגבלת זיהוי של 70.5 פג'/ערוץ.
כצפוי, PCR מהיר הוא כלי רב עוצמה עבור מערכות אבחון מולקולריות וניתוח מולטיפלקס משולבות במלואן.PCR מהיר מפחית באופן משמעותי את הזמן הנדרש לזיהוי SARS-CoV-2, מה שתורם לשליטה יעילה במגפת COVID-19.
PCR דורש מחזור תרמי מורכב שאינו מתאים ל-POCT.לאחרונה, טכניקות הגברה איזותרמיות יושמו במיקרו-נוזליות, כולל אך לא רק LAMP, הגברה של ריקומבינאז פולימראז (RPA) והגברה המבוססת על רצפי חומצות גרעין [65,66,67,68].בעזרת טכניקות אלו, חומצות גרעין מוגברות בטמפרטורה קבועה, מה שמקל על יצירת התקני POCT ניידים רגישים בעלות נמוכה לאבחון מולקולרי.
מבחני LAMP מבוססי מיקרו-נוזלים בעלי תפוקה גבוהה מאפשרים זיהוי מרובה של מחלות זיהומיות [42, 69, 70, 71].בשילוב עם מערכת מיקרופלואידית צנטריפוגלית, LAMP יכול להקל עוד יותר על האוטומציה של זיהוי חומצות גרעין [69, 72, 73, 74, 75].ה-Spin-and-react SlipChip פותח לזיהוי חזותי של מספר חיידקים מקבילים באמצעות LAMP [76] (איור 4a).בעת שימוש ב-LAMP אופטימלי במבחן, יחס האות לרעש הקרינה היה פי 5 בערך, ומגבלת הזיהוי הגיעה ל-7.2 עותקים/μl של DNA גנומי. יתרה מכך, קיומם של חמישה פתוגנים נפוצים של חיידקי עיכול, כולל Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis ו-Vibrio parahaemolyticus, הוצגו בהתבסס על השיטה תוך פחות מ-60 דקות. יתרה מכך, קיומם של חמישה פתוגנים נפוצים של חיידקי עיכול, כולל Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis ו-Vibrio parahaemolyticus, הוצגו בהתבסס על השיטה תוך פחות מ-60 דקות.יתרה מכך, נוכחותם של חמישה פתוגנים חיידקיים נפוצים של מערכת העיכול, כולל Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis ו-Vibrio parahaemolyticus, הוצגה בשיטה זו תוך פחות מ-60 דקות.此外 t此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 的 存在 ， 包括 芽孢杆菌 大 肠杆菌 、 肠 氏 菌 、 弧菌 和 副溶血 。。。 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPבנוסף, נוכחותם של חמישה פתוגנים חיידקיים במערכת העיכול הנפוצים, כולל Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius ו-Vibrio parahaemolyticus, הוצגה בשיטה זו תוך פחות מ-60 דקות.
היתרונות של LAMP במיקרופלואידיקה כוללים, בין היתר, תגובה מהירה וזיהוי ממוזער.עם זאת, בשל טמפרטורת התגובה (בסביבות 70 מעלות צלזיוס), נוצרים בהכרח אירוסולים במהלך LAMP, וכתוצאה מכך שיעור חיובי שגוי גבוה.יש לבצע אופטימיזציה של ספציפיות המבחן, עיצוב הפריימר ובקרת הטמפרטורה עבור LAMP.בנוסף, לעיצובי שבבים המיישמים זיהוי מטרות מרובות על שבב בודד יש ערך רב ויש לפתח אותם.בנוסף, LAMP מתאים לזיהוי רב תכליתי משולב בשבב אחד, שיש לו חשיבות רבה, אך יש עדיין הרבה מקום לפיתוח.
ניתן להפחית חלקית את שיעור חיובי השווא הגבוה של LAMP עם RPA, מכיוון שטמפרטורת התגובה הנמוכה יחסית (~37 מעלות צלזיוס) גורמת לבעיות אידוי מעטות יחסית [77].במערכת RPA, שני פריימרים מנוגדים מתחילים סינתזת DNA על ידי קישור לרקומבינאז וניתן להשלים את ההגברה תוך 10 דקות [78,79,80,81].לכן, כל תהליך ה-RPA מהיר הרבה יותר מאשר PCR או LAMP.בשנים האחרונות, הוכח כי טכנולוגיית מיקרופלואידית משפרת עוד יותר את המהירות והדיוק של RPA [82,83,84].לדוגמה, Liu et al.[85] פיתח מבחן הגברה של זרימה צידית של פולימראז רקומבינאז משולבת מיקרופלואידית לזיהוי מהיר ורגיש של SARS-CoV-2 על ידי שילוב RPA של שעתוק הפוך (RT-RPA) ומערכת אוניברסלית לזיהוי רצועות זרימה לרוחב.לתוך מערכת מיקרופלואידית אחת.איור 4ב).מגבלת הזיהוי היא 1 עותק/µl או 30 עותקים/דגימה, וניתן להשלים את הזיהוי תוך כ-30 דקות.קונג וחב'.פיתחו מכשיר מיקרופלואידי לביש.[86] השתמש בטמפרטורת גוף ובמערכת זיהוי פלואורסצנטי מבוססת טלפון נייד כדי לזהות במהירות ובאופן ישיר DNA של HIV-1 באמצעות RPA (איור 4c).מבחן ה-RPA הלביש מזהה 100 עותקים/מ"ל של רצף היעד תוך 24 דקות, מה שמוכיח פוטנציאל גדול לאבחון מהיר של תינוקות נגועים ב-HIV-1 במסגרות מוגבלות במשאבים.
הגברה איזותרמית בבדיקת נקודת טיפול (POCT).פיתוח וייצור של ספין וריאקציה SlipChip.לאחר ריתוך פלזמה, השבבים העליונים והתחתונים הורכבו עם סט אגוזים ליצירת השבב הסופי (מותאם מ-[76]).ב סכימה של מערכת MI-IF-RPA לזיהוי COVID-19 (מותאם מ-[85]).ג סכמטי של בדיקת RPA לבישה לזיהוי מהיר של DNA-1 HIV (מותאם מ-[86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM carboxyfluorescein, וירוס כשל חיסוני אנושי HIV, הגברה RPA recombinase פולימראז, דיודה פולטת אור LED, MI-IF-Low-RPA Polymerase Integrated Microfluidics הַגבָּרָה
RPA מבוסס מיקרופלואיד מתפתח במהירות, עם זאת, עלות ייצור השבבים וצריכת התגובה גבוהה מדי ויש להפחיתם כדי להגדיל את הזמינות של טכנולוגיה זו.בנוסף, הרגישות הגבוהה של RPA יכולה להשפיע על ההגברה של מוצרים לא ספציפיים, במיוחד בנוכחות זיהום.מגבלות אלו עשויות להשפיע על היישום של RPA במערכות מיקרופלואידיות ולזכות אופטימיזציה נוספת.יש צורך גם בפריימרים ובדיקות מתוכננות היטב עבור מטרות שונות כדי לשפר את ההיתכנות של אסטרטגיות מיקרו-נוזליות מבוססות RPA ב-POCT.
ל-Cas13 ול-Cas12a יש את היכולת לפצל באופן אקראי חומצות גרעין ובכך ניתן לפתח אותם ככלי איתור ואבחון.Cas13 ו-Cas12a מופעלים עם קישור ל-DNA או RNA יעד, בהתאמה.לאחר הפעלת החלבון, החלבון מתחיל לבקע חומצות גרעין סמוכות אחרות, ולאחר מכן RNAs מדריכים המכוונים לחומצות גרעין ספציפיות לפתוגן יכולים לבקע בדיקות פלואורסצנטיות מרוויות ולשחרר פלואורסצנטיות.בהתבסס על תיאוריה זו, Kellner et al.[87] פיתח שיטה מבוססת Cas13 [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)], ו-Broughton et al.[88] פיתח גישה נוספת המבוססת על Cas12a [CRISPR Trans Reporter מכוון לאנדונוקלאז DNA (DTECR)].
בשנים האחרונות הופיעו שיטות שונות לזיהוי חומצות גרעין המבוססות על CRISPR [89, 90].שיטות קונבנציונליות מבוססות CRISPR גוזלות זמן רב ודורשות עבודה עקב נהלים רבים, כולל מיצוי חומצת גרעין, הגברה וזיהוי CRISPR.חשיפה של נוזלים לאוויר עלולה להגביר את הסיכוי לתוצאות חיוביות כוזבות.לאור האמור לעיל, מערכות מבוססות CRISPR זקוקות מאוד לאופטימיזציה.
פלטפורמה מיקרופלואידית מבוקרת פנאומטית שיכולה לבצע 24 ניתוחים במקביל פותחה עבור יישומי זיהוי CRISPR-Cas12a ו-CRISPR-Cas13a [91].המערכת מצוידת במכשיר זיהוי פלואורסצנטי עוקף הגברה של חומצות גרעין ומזהה אוטומטית דגימות DNA ו-RNA פמטומלר.חן וחב'.[92] משולבת הגברה של רקומבינאז עם מערכת CRISPR-Cas12a במיקרו-נוזלים צנטריפוגליים (איור 5a).עבודה זו מתגברת על הקושי של שילוב שני התהליכים הללו מכיוון ש-Cas12a יכול לעכל DNA שליח ולעכב את תהליך ההגברה.בנוסף, חן וחב'.[92] בנוסף אחסנו מראש את ריאגנטים התגובה בבקרה מיקרופלואידית צנטריפוגלי כדי להשלים אוטומטית את כל התהליך.בעבודה אחרת, סילבה וחב'.[93] פיתח שיטת אבחון ללא הגברה של CRISPR/Cas12a וסמארטפון לזיהוי SARS-CoV-2 (איור 5b).בדיקה זו, הידועה כמערכת נטולת הגברה מבוססת טלפונים סלולריים, כוללת אנזים תלוי CRISPR/Cas המבוסס על הדמיה בסמארטפון של אותות בועות שנוצרו על ידי קטלאז בתעלות מיקרופלואידיות.זיהוי רגיש של פחות מ-50 עותקים/µl של חומצת גרעין ללא הגברה מוקדמת, כל התהליך מהזרקת הדגימה ועד קריאת האותות לוקח רק 71 דקות.
שיטות זיהוי חומצות גרעין המבוססות על CRISPR.POCT צנטריפוגלי לאבחון מולקולרי משולב המבוסס על CRISPR (מותאם מ-[92]).ב פיתוח מבחן CASCADE לניתוח מבוסס סמארטפון של SARS-CoV-2 (מותאם מ-[93]).הגברה של RAA רקומבינאז, מוטיב פרוטו-ספייס צמוד ל-PAM, חזרות פלינדרום קצרות מקובצות ב-CRISPR במרווחי זמן קבועים, מערכת CASCADE ללא הגברה בטלפון סלולרי עם אנזימים תלויי CRISPR/CAS, 1-אתיל-3-[3-דימתיל-אמינופרופיל]קרבודיאימיד הידרוכלוריד EDC
כשלב האחרון בגילוי חומצות גרעין, זיהוי האותות משקף ישירות את תוצאות האבחון ומהווה גורם קריטי בפיתוח של POCT יעיל, רגיש ומדויק.ניתן לקרוא אותות באמצעות שיטות שונות כגון אסטרטגיות פלורסנט, אלקטרוכימיות, קולורימטריות ומגנטיות.בחלק זה, אנו מתארים את הרציונל לכל גישה ומשווים את האבחון המולקולרי של מחלות זיהומיות במיקרו-נוזליות.
אסטרטגיות מבוססות פלואורסצנציה נמצאות בשימוש נרחב לאבחון POCT של מחלות זיהומיות בשל יתרונותיהן המדהימים של רגישות מצוינת, עלות נמוכה, קלות תפעול וניתוח נקודתי טיפול [94, 95].אסטרטגיות אלו משתמשות בפלואורופורים מסומנים כגון צבעים פלואורסצנטיים וננו-חומרים כדי ליצור אות הניתן לזיהוי (שיפור פלואורסצנטי או כיבוי).ממצא זה מצביע על כך שניתן לחלק אסטרטגיות המבוססות על פלואורסצנטי לתיוג פלורסנט ישיר, זיהוי פלורסנט להפעלת אותות וכבוי אות [96].זיהוי תווית ניאון ישיר משתמש בתוויות פלורסנט מיוחדות כדי לתייג ליגנדים ספציפיים היוצרים כמות מסוימת של פלואורסצנטי כאשר הם נקשרים באופן סלקטיבי למטרה.עבור זיהוי פלואורסצנטי מבוסס-אות, איכות האות הפלורסנטי קשורה באופן חיובי לגודל העניין.עוצמת הקרינה זניחה בהיעדר מטרה וניתנת לזיהוי כאשר קיימת כמות מספקת של מטרה.לעומת זאת, עוצמת הקרינה המזוהה על ידי הקרינה "כיבוי אות" עומדת ביחס הפוך לכמות המטרה, בתחילה מגיעה לערך מקסימלי ויורדת בהדרגה ככל שהמטרה גדלה.לדוגמה, באמצעות מנגנון ה-trans-cleavage תלוי-מטרה CRISPR-Cas13a, Tian et al.[97] פיתח אסטרטגיית זיהוי חדשה לאיתור RNAs שעוקפים תעתיק הפוך ישירות (איור 6א).לאחר הקישור ל-RNAs מטרה משלימים, ניתן להפעיל את קומפלקס CRISPR-Cas13-RNA, מה שגורם למחשוף טרנס-קולטראלי על ידי RNAs לא ספציפיים.הכתב עם התווית פלואורסצנטית [fluorophore (F)] מרוווה על ידי המרווה (Q) שלם וקורח כאשר הוא מבוקע על ידי הקומפלקס המופעל.
היתרון של גילוי אלקטרוכימי הוא מהירות זיהוי גבוהה, ייצור קל, עלות נמוכה, קל לנשיאה ובקרה אוטומטית.זוהי שיטה אנליטית רבת עוצמה עבור יישומי POCT.מבוסס על טרנזיסטורי גרפן אפקט שדה Gao et al.[98] פיתח ננו-ביוסנסור לזיהוי מרובה של אנטיגנים ממחלת ליים מחיידקי Borrelia burgdorferi עם מגבלת זיהוי של 2 pg/mL (איור 6b).
נעשה שימוש במבחנים קולורימטריים ביישומי POCT, הנהנים מהיתרונות של ניידות, עלות נמוכה, קלות הכנה וקריאה חזותית.זיהוי קולורימטרי יכול להשתמש בחמצון של פרוקסידאז או ננו-חומרים דמויי פרוקסידאז, צבירה של ננו-חומרים והוספת צבעי אינדיקטור כדי להמיר מידע על נוכחות חומצות גרעין מטרה לשינויי צבע גלויים [99, 100, 101].יש לציין כי ננו-חלקיקי זהב נמצאים בשימוש נרחב בפיתוח אסטרטגיות קולורימטריות, ובשל יכולתם לגרום לשינויי צבע מהירים ומשמעותיים, יש עניין גובר בפיתוח פלטפורמות קולורימטריות POCT לאבחון במקום של מחלות זיהומיות [102].עם מכשיר מיקרו-נוזל צנטריפוגלי משולב [103], ניתן לזהות אוטומטית פתוגנים הנישאים במזון בדגימות חלב מזוהמות ברמה של 10 תאים חיידקיים, וניתן לקרוא את התוצאות חזותית תוך 65 דקות (איור 6c).
טכניקות חישה מגנטיות יכולות לזהות במדויק אנליטים באמצעות חומרים מגנטיים, והיה עניין משמעותי ביישומי POCT בעשורים האחרונים.לטכניקות חישה מגנטית יש כמה יתרונות ייחודיים כמו חומרים מגנטיים בעלות נמוכה ולא רכיבים אופטיים יקרים.עם זאת, השימוש בשדה מגנטי משפר את יעילות הגילוי ומפחית את זמן הכנת הדגימה [104].בנוסף, התוצאות של בדיקה מגנטית מדגימות ספציפיות גבוהה, רגישות ויחס אות לרעש גבוה עקב אות הרקע המגנטי חסר החשיבות של דגימות ביולוגיות [105].שארמה וחב'.שילב ביו-חיישן מבוסס צומת מנהרה מגנטי בפלטפורמת מיקרו-שבב ניידת.[106] לזיהוי מרובה של פתוגנים (איור 6ד).חיישנים ביולוגיים מזהים ברגישות חומצות גרעין תת-ננומולריות המבודדות מפתוגנים.
שיטת זיהוי אותות טיפוסית.הרעיון של זיהוי היפר-לוקאלי של Cas13a (מותאם מ-[97]).b Graphene nanobiosensor FET בשילוב עם Lyme GroES scFv (מותאם מ-[98]).ג אינדיקציות קולורימטריות לזיהוי מרובה של פתוגנים הנישאים במזון בשבב מיקרופלואידי צנטריפוגלי: דגימות מס' 1 ו-3 עם פתוגני מטרה, ודגימות מס' 2, מס' 4 ו-5 ללא פתוגני מטרה (מותאם מ-[103]) .ד ביו-חיישן המבוסס על צומת מנהרה מגנטי, כולל פלטפורמה, מגבר חסימה מובנה, יחידת בקרה, וספק כוח להפקת/רכישת אותות (מותאם מ-[106]).GFET Graphene FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimethicone, PMMA polymethyl methacrylate
למרות המאפיינים המצוינים של שיטות האיתור לעיל, עדיין יש להן חסרונות.שיטות אלו מושוות (טבלה 1), כולל כמה יישומים עם פרטים (יתרונות וחסרונות).
עם התפתחותם של מיקרו-נוזלים, מערכות מיקרו-אלקטרו-מכאניות, ננוטכנולוגיה ומדעי החומרים, השימוש בשבבים מיקרו-נוזליים לזיהוי מחלות זיהומיות מתקדם ללא הרף [55,96,107,108].מניפולציה מדויקת של ציוד ונוזלים מיניאטוריים תורמת לדיוק האבחון ולחסכוניות.לכן, לצורך פיתוח נוסף, נעשו מאמצים לייעל ולשדרג את השבבים, וכתוצאה מכך שבבים מיקרופלואידים שונים בעלי מבנים ותפקודים שונים.כאן אנו מציגים בקצרה כמה סוגים נפוצים של פלטפורמות מיקרופלואידיות ומשווים את המאפיינים שלהן (יתרונות וחסרונות).בנוסף, רוב הדוגמאות המפורטות להלן מתמקדות בעיקר במאבק ב- SARS-CoV-2.
LOCCs הן המערכות האנליטיות המורכבות הממוזערות הנפוצות ביותר ופעולותיהן ממוזערות ביותר, משולבות, אוטומטיות ומקבילות מהזרקה והכנת דגימות, בקרת זרימה וזיהוי נוזלים [109, 110].נוזלים עוברים מניפולציה באמצעות גיאומטריה שתוכננה בקפידה ואינטראקציה של השפעות פיזיקליות רבות כגון שיפוע לחץ, פעולת קפילרית, אלקטרודינמיקה, שדות מגנטיים וגלים אקוסטיים [111].LOCC מציג יתרונות מצוינים בהקרנה בתפוקה גבוהה ובזיהוי מרובה, עם מהירות ניתוח מהירה, גודל מדגם קטן, צריכת חשמל נמוכה ויעילות ניהול ותפעול גבוהים;עם זאת, מכשירי LOCC עדינים מאוד, וייצור, אריזה וממשק.עם זאת, ריבוי ושימוש חוזר מתמודדים עם קשיים עצומים [96].בהשוואה לפלטפורמות אחרות, ל-LOCC יש יתרונות ייחודיים במונחים של גיוון יישומים מקסימלי ותאימות טכנולוגית מיטבית, אך גם חסרונותיה ברורים, כלומר מורכבות גבוהה וחזרתיות גרועה.התלות במשאבות חיצוניות, שהן לרוב מגושמות ויקרות, מגבילה עוד יותר את השימוש בהן ב-POCT.
במהלך התפרצות COVID-19, LOCC זכה לתשומת לב רבה.יחד עם זאת, ישנם מספר שבבים חדשים המשלבים מספר טכנולוגיות.לדוגמה, סמארטפונים נמצאים כיום בשימוש נרחב כמכשירי ניתוח ניידים ויש להם פוטנציאל גדול לאינטגרציה של LOCC.Sun et al.[21] ייצר שבב מיקרופלואידי המאפשר ריבוי רצפי חומצות גרעין ספציפיות של חמישה פתוגנים, כולל SARS-CoV-2, באמצעות LAMP וניתח אותם באמצעות סמארטפון תוך שעה אחת לאחר סיום התגובה.כדוגמה נוספת, Sundah et al.[112] יצר מתג מולקולרי [הגברה קטליטית באמצעות מתג מצב מעבר מולקולרי (CATCH)] לזיהוי ישיר ורגיש של מטרות RNA SARS-CoV-2 באמצעות סמארטפונים. CATCH תואם ל-LOCC נייד ומשיג ביצועים מעולים (כ-8 עותקי RNA/μl; פחות משעה בטמפרטורת החדר) [112]. CATCH תואם ל-LOCC נייד ומשיג ביצועים מעולים (כ-8 עותקי RNA/μl; פחות משעה בטמפרטורת החדר) [112]. לתפוס את совесим сортативны locc и оесечивает преводню произодееен н у у; CATCH תואם ל-LOCC נייד ומספק תפוקה מעולה (כ-8 עותקי RNA/µl; < שעה בטמפרטורת החדר) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 אוקטובר[112] CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 אוקטובר[112] CATCH совместим с портативными LOCC и обладает превосходной производительностью (примерно 8 копий РНК/мкрет] 1 копий РНК/мкрит. CATCH תואם ל-LOCCs ניידים ובעל ביצועים מצוינים (כ-8 עותקי RNA/µl; פחות משעה בטמפרטורת החדר) [112].בנוסף, מכשירי LOCC לאבחון מולקולרי משתמשים גם בכמה כוחות מניעים כגון ואקום, מתיחה ושדות חשמליים.קאנג וחב'.[113] הדגים ננופלזמה-על-שבב PCR בזמן אמת ומהיר במיוחד לאבחון מהיר וכמותי של COVID-19 בשטח באמצעות שבב PCR נוזלי פלסמוני ואקום.לי וחב'.[114] פיתח לאחר מכן שבב מיקרו-נוזל מונע מתיחה שאיפשר את האבחנה של COVID-19.הפלטפורמה משתמשת במערכת ההגברה RT-LAMP כדי לקבוע אם דגימה חיובית או שלילית מבחינה איכותית.לאחר מכן, Ramachandran et al.[115] השיג שיפועים מתאימים של שדה חשמלי באמצעות איזוטכופורזה (ITP), טכניקת מיקוד יונים סלקטיבית המיושמת במיקרו-נוזלים.עם ITP, ניתן לטהר אוטומטית RNA יעד מדגימות ספוגיות נאות-לוע גולמיות.ואז Ramachandran et al.[115] שילוב של טיהור ITP זה עם מבחני LAMP ו-CRISPR משופרים ב-ITP גילה SARS-CoV-2 בספוגית אף-לוע אנושית ובדגימות קליניות תוך כ-35 דקות.בנוסף, כל הזמן צצים רעיונות חדשים.ג'דהב ואחרים.[116] הציע תכנית אבחון המבוססת על ספקטרוסקופיה מוגברת של ראמאן על פני השטח בשילוב עם מכשיר מיקרו-נוזל המכיל או ננו-צינורות פחמן מצופים זהב/כסף בכיוון אנכי או מיקרו/ננו-צינוריות חד-פעמיות.מיקרו-ערוצי מסנן מובנים בפונקציונליות הממברנה הם חד פעמיים.המכשיר סופח וירוסים מנוזלי הגוף/הפרשות שונות כגון רוק, אף ודמעות.לפיכך, טיטר הנגיף נמצא בשפע וניתן לזהות את הנגיף במדויק על ידי חתימת ראמאן.
LOAD היא פלטפורמה מיקרופלואידית צנטריפוגלית שבה כל התהליכים נשלטים על ידי פרוטוקול תדר המסובב מצע מיקרו מובנה [110].התקן LOAD מאופיין בשימוש בכוח צנטריפוגלי ככוח מניע חשוב.נוזלים נתונים גם לכוחות נימיים, אוילר וקוריוליס.באמצעות מכשיר צנטריפוגה, ניתוחים מבוצעים בפעולת נוזל רציפה ממצב רדיאלי פנימה אל חוץ, ומבטל את הצורך בצינורות חיצוניים נוספים, משאבות, מפעילים ושסתומים פעילים.בקיצור, שיטת בקרה אחת מפשטת את הפעולה.הכוחות הפועלים על הנוזל באותה תעלה מיקרופלואידית באותו מרחק ממרכז העומס שווים, מה שמאפשר לחזור על מבנה הערוץ.לפיכך, ציוד LOAD פשוט וחסכוני יותר לתכנון וייצור מאשר ציוד LOCC קונבנציונלי, בעוד שהתגובות הן במידה רבה בלתי תלויות ומקבילות;עם זאת, בשל החוזק המכני הגבוה של ציוד צנטריפוגלי, חומר השבב הזמין מוגבל ונפחים קטנים קשים.לרכב.יחד עם זאת, רוב מכשירי ה-LOAD מיועדים לשימוש חד פעמי בלבד, דבר היקר לזיהוי בקנה מידה גדול [96, 117, 118, 119].
בעשורים האחרונים, LOAD, הנחשב לאחד מהמכשירים המיקרופלואידיים המבטיחים ביותר, זכה לתשומת לב רבה מצד חוקרים ויצרנים.לפיכך, LOAD זכה לקבלה רחבה ושימש לאבחון מולקולרי של פתוגנים זיהומיים [120, 121, 122, 123, 124], במיוחד במהלך התפרצות COVID-19.לדוגמה, בסוף 2020, Ji et al.[60] הדגימה בדיקת RT-qPCR ישירה לזיהוי מקביל מהיר ואוטומטי של SARS-CoV-2 וזיהומי שפעת A ו-B בדגימות משטח גרון.ואז Xiong et al.[74] הציג פלטפורמה מיקרופלואידית דיסקואידית משולבת ב-LAMP לזיהוי מהיר, מדויק ובו-זמני של שבעה נגיפים נשימתיים אנושיים, כולל SARS-CoV-2, תוך 40 דקות.בתחילת 2021, דה Oliveira et al.[73] הדגים שבב מיקרופלואידי צנטריפוגלי של טונר פוליסטירן, המופעל באופן ידני עם מסובב קצות אצבעות, לאבחון מולקולרי RT-LAMP של COVID-19.לאחר מכן, Dignan et al.[39] הציג מיקרו-מכשיר צנטריפוגה נייד אוטומטי לטיהור של SARS-CoV-2 RNA ישירות מקטעי ספוגית חזה.מדבד וחב'.[53] הציע מערכת דגימת אירוסול מובנה של SARS-CoV-2 עם שבב פלורסנט מיקרופלואידי מסתובב בנפח קטן עם מגבלת זיהוי של 10 עותקים/μL וסף מחזור מינימלי של 15 דקות.סוארז וחב'.[75] דיווח לאחרונה על פיתוח של פלטפורמה צנטריפוגלית צנטריפוגלית משולבת לזיהוי ישיר של SARS-CoV-2 RNA בדגימות ספוגיות באף-לוע מושבתות בחום באמצעות LAMP.דוגמאות אלו מדגימות את היתרונות וההבטחה הגדולים של LOAD באבחון מולקולרי של COVID-19.
ב-1945 הציגו מולר וקלג [125] לראשונה תעלות מיקרו-נוזליות על נייר באמצעות נייר סינון ופרפין.בשנת 2007, קבוצת Whitesides [126] יצרה את פלטפורמת הנייר הפונקציונלית הראשונה לבדיקת חלבון וגלוקוז.נייר הפך למצע אידיאלי עבור מיקרופלואידים.לנייר תכונות מובנות כגון הידרופיליות ומבנה נקבובי, תאימות ביולוגית מעולה, משקל קל, גמישות, קיפול, עלות נמוכה, קלות שימוש ונוחות.µPADs קלאסיים מורכבים ממבנים הידרופיליים/הידרופוביים הבנויים על מצעי נייר.בהתאם למבנה התלת מימדי, ניתן לחלק את מכשירי μPAD ל- μPAD דו מימדיים (2D) ותלת מימדיים (3D).2D µPADs מיוצרים על ידי יצירת גבולות הידרופוביים ליצירת תעלות מיקרו-נוזליות, בעוד ש- µPAD 3D מיוצרים בדרך כלל מערימות של שכבות של נייר מיקרו-נוזל 2D, לפעמים על ידי קיפול נייר, טכניקות החלקה, ערוצים פתוחים והדפסה תלת מימדית [96].נוזלים מימיים או ביולוגיים ב-μPAD נשלטים בעיקר על ידי כוח נימי ללא מקור כוח חיצוני, מה שמקל על אחסון מראש של ריאגנטים, טיפול בדגימות וזיהוי מרובי.עם זאת, בקרת זרימה מדויקת וזיהוי מרובי נפגעים על ידי מהירות זיהוי, רגישות ושימוש חוזר לא מספיקים [96, 127, 128, 129, 130].
כפלטפורמה מיקרופלואידית יוצאת דופן, μPAD זכה לקידום ופיתוח נרחב לאבחון מולקולרי של מחלות זיהומיות כגון HCV, HIV ו-SARS-CoV-2 [131, 132].לזיהוי סלקטיבי ורגיש של HCV, Tengam et al.[133] פיתח ביו-חיישן חדש המבוסס על נייר פלואורסצנטי באמצעות בדיקה ספציפית ביותר של חומצת גרעין המבוססת על פפטיד פירולידיניל.חומצות גרעין משותקות באופן קוולנטי על נייר תאית מחומצן חלקית על ידי אלקילציה רדוקטיבית בין קבוצות אמינו וקבוצות אלדהיד, והזיהוי מבוסס על פלואורסצנטיות.את האותות הללו ניתן לקרוא על ידי גאדג'ט שנעשה במיוחד עם מצלמת פלורסנט ניידת בשילוב מצלמת טלפון סלולרי.לאחר מכן, Lu et al.[134] עיצב אלקטרודה גמישה מבוססת נייר המבוססת על ננו-חלקיקי ניקל/זהב/ננו-צינוריות פחמן/חומרי מסגרת אורגנו-מתכתיים של אלכוהול פוליוויניל לזיהוי יעדי HIV על ידי הכלאה של DNA באמצעות מתילן כחול כאינדיקטור חיזור של DNA.לאחרונה, Chowdury et al.[135] הציג עיצוב פלטפורמה היפותטית לבדיקת µPAD בנקודת טיפול באמצעות רוק גולמי של מטופל בשילוב עם LAMP וטכנולוגיית הדמיה ניידת לזיהוי אנליטים של COVID-19.
מבחני זרימה לרוחב מנחים נוזלים על ידי כוחות נימיים ושולטים בתנועת הנוזל על ידי הרטיבות ומאפיינים של מצעים נקבוביים או מיקרו-מובנים.מכשירי הזרימה לרוחב מורכבים מדגימה, מצומד, אינקובטור וזיהוי, ומשטחים סופגים.מולקולות חומצת הגרעין ב-LFA מזהות קושרים ספציפיים המאוחסנים מראש באתר הקישור ונקשרים כקומפלקסים.כשהנוזל עובר דרך לוחות הדגירה והאיתור, הקומפלקסים נלכדים על ידי מולקולות הלכידה הממוקמות על קווי הבדיקה והבקרה, ומציגות תוצאות שניתן לקרוא ישירות לעין בלתי מזוינת.בדרך כלל, ניתן להשלים את LFA תוך 2-15 דקות, וזה מהיר יותר מגילוי מסורתי.בשל המנגנון המיוחד, LFA דורש מעט פעולות ואינו מצריך ציוד נוסף, מה שהופך אותו לידידותי מאוד למשתמש.קל לייצור ולמזעור, והעלות של מצעים מבוססי נייר נמוכה יותר.עם זאת, הוא משמש רק לניתוח איכותי, והגילוי הכמותי קשה מאוד, ויכולת הריבוי והתפוקה מוגבלים מאוד, וניתן לזהות רק חומצת גרעין אחת מספקת בכל פעם [96,110,127].
למרות שרוב היישומים של LFA מתמקדים בבדיקות אימונו, השימוש ב-LFA לאבחון מולקולרי בשבבים מיקרופלואידיים הוא גם יעיל ופופולרי [136].במקרה של וירוס הפטיטיס B, HIV ו-SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] הציע פלטפורמת LFA ננו-חלקיקים להמרה מעלה והדגימה את הרבגוניות של פלטפורמה ממוזערת וניידת זו באמצעות זיהוי רגיש וכמותי של מטרות מרובות כגון חומצת גרעין HBV.בנוסף, Fu et al.[138] הדגים LFA חדש המבוסס על ספקטרוסקופיה ראמאן משופרת על פני השטח לניתוח כמותי של DNA-1 HIV בריכוזים נמוכים.לזיהוי מהיר ורגיש של SARS-CoV-2, Liu et al.[85] פיתח ניתוח זרימה רוחבית RPA משולבת במיקרו-נוזל על ידי שילוב של RT-RPA ומערכת זיהוי זרימה רוחבית אוניברסלית למערכת מיקרו-נוזלית אחת.
היישום של פלטפורמות מיקרופלואידיות שונות משתנה בהתאם למחקרים ספציפיים, תוך ניצול מלא של היכולות והיתרונות של הפלטפורמות.עם שסתומים, משאבות ותעלות במחירים נוחים, LOCC היא הפלטפורמה המקיפה ביותר לגיוון יישומים ויכולת פעולה הדדית עם מרחב הפיתוח הגדול ביותר.לכן, אנו מקווים וממליצים שהמחקרים החדשים ביותר יתבצעו ב-LOCC כניסיון ראשון ושהתנאים יהיו אופטימליים.בנוסף, צפויות להתגלות ולהשתמש במערכת שיטות יעילות ומדויקות יותר.LOAD מצטיינת בשליטה מדויקת על נוזלים ממכשירי LOCC קיימים ומדגימה יתרונות ייחודיים בכוננים בודדים בכוח צנטריפוגלי ללא צורך בכוננים חיצוניים, בעוד שתגובות מקבילות יכולות להיות נפרדות ומסונכרנות.לפיכך, בעתיד, LOAD תהפוך לפלטפורמה המיקרופלואידית העיקרית עם פחות פעולות ידניות וטכנולוגיות בוגרות ואוטומטיות יותר.פלטפורמת µPAD משלבת את היתרונות של LOCC וחומרים מבוססי נייר לאבחון בעלות נמוכה לשימוש חד פעמי.לכן, פיתוח עתידי צריך להתמקד בטכנולוגיות נוחות ומבוססות.בנוסף, ה-LFA מתאים היטב לזיהוי עין בלתי מזוינת, ומבטיח להפחית את צריכת הדגימות ולהאיץ את הגילוי.השוואה מפורטת של פלטפורמות מוצגת בטבלה 2.
ניתוחים דיגיטליים מחלקים את המדגם למיקרו-ריאקטורים רבים, שכל אחד מהם מכיל מספר נפרד של מולקולות מטרה [139, 140].מבחנים דיגיטליים מציעים יתרונות משמעותיים לביצוע כמות מוחלטת על ידי ביצוע אלפי ניסויים ביוכימיים מקבילים בו זמנית ובפרט בתאים בקנה מידה מיקרון ולא בשלב רציף.בהשוואה למיקרו-נוזלים מסורתיים, תגובות תא יכולות להפחית את נפח הדגימה, להגביר את יעילות התגובה ולהשתלב בקלות עם שיטות אנליטיות אחרות ללא צורך בתעלות, משאבות, שסתומים ועיצובים קומפקטיים [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147] .שתי השיטות הבאות משמשות במבחנים דיגיטליים כדי להשיג הפרדה אחידה ומדויקת של פתרונות, כולל ריאגנטים ודגימות כגון תאים, חומצות גרעין וחלקיקים או מולקולות אחרים: (1) תחליבים טיפה המנצלים חוסר יציבות של ממשק נוזלי;(2) חלוקת המערך מתבצעת לפי האילוצים הגיאומטריים של המכשיר.בשיטה הראשונה, ניתן ליצור טיפות המכילות ריאגנטים ודגימות במיקרו-ערוצים בשיטות פסיביות כמו זרם משותף, זרימה צולבת, מיקוד זרימה, אמולסיפיקציה שלב, אמולסיציה מיקרו-ערוצית וממברנות באמצעות כוחות גזירה צמיגים ואמולסיפיקציה עם שינוי תעלה.לוקליזציה [143, 145, 146, 148, 149] או שימוש בשיטות אקטיביות [150, 151], המכניסות אנרגיה נוספת באמצעות בקרה חשמלית, מגנטית, תרמית ומכאנית.בגישה האחרונה, אחידות נפח הנוזל הטובה ביותר בתאי מיקרו-נוזל משותפת על ידי שמירה על מבנים מרחביים באותו גודל, כגון מיקרו בורות ומערכים משטחים [152,153,154].יש לציין, טיפות הן קטעי זרימה עיקריים שניתן ליצור ולתפעל גם על מערכי אלקטרודות המבוססים על מיקרו-נוזל דיגיטלי (DMF).הרטבה חשמלית של דיאלקטריים היא אחת מתיאוריות ה-DMF שנחקרו בצורה הטובה ביותר, שכן הרטבה חשמלית של דיאלקטריות מאפשרת מניפולציה מדויקת של טיפות בודדות, שליטה בצורת האותות החשמליים הנוזליים והאסימטריים העוברים דרך צדדים שונים [141, 144].הפעולות העיקריות עם טיפות ב-DMF כוללות מיון, פיצול ומיזוג [151, 155, 156], אשר ניתן ליישם בתחומי ניתוח שונים, במיוחד בזיהוי מולקולרי [157, 158, 159].
זיהוי חומצות גרעין דיגיטליות הוא דור שלישי לטכנולוגיית אבחון מולקולרית בעקבות PCR קונבנציונלי ו-PCR כמותי בזמן אמת (qPCR), במקביל לרצף תפוקה גבוהה וביופסיה נוזלית.בשני העשורים האחרונים, חומצות גרעין דיגיטליות התפתחו במהירות בתחום האבחון המולקולרי של פתוגנים זיהומיים [160, 161, 162].כימות מוחלט של זיהוי חומצות גרעין דיגיטליות מתחיל עם אריזה של דגימות וריאגנטים לתוך תאים בודדים כדי להבטיח שלכל רצף מטרה יש אותה הסתברות להיכנס לכל תא בודד.תיאורטית, לכל קטע עשוי להיות רצפי יעד מרובים, או שלא תהיה מערכת מיקרו-תגובה עצמאית.באמצעות מנגנוני החישה השונים שתוארו לעיל, ניתן לראות תאים עם רצפי מטרה מיקרוביאליים המייצרים אותות מעל סף מסוים בעין בלתי מזוינת או באמצעות מכונה ומסומנים כחיוביים, בעוד שתאים אחרים המייצרים אותות מתחת לסף מסומנים כחיוביים. .שליליים, שהופכים את האות עבור כל קטע לבוליאני.לפיכך, על ידי חישוב מספר התאים שנוצרו ושיעור התוצאות החיוביות לאחר התגובה, ניתן להתאים את העותקים המקוריים של דגימות הבדיקה באמצעות נוסחת התפלגות Poisson ללא צורך בעקומה סטנדרטית, הנדרשת לניתוחים כמותיים שגרתיים כגון בתור qPCR.[163] בהשוואה לשיטות אבחון מולקולריות מסורתיות, לזיהוי חומצות גרעין דיגיטליות יש דרגת אוטומציה גבוהה יותר, מהירות ניתוח ורגישות גבוהה יותר, פחות ריאגנטים, פחות זיהום ותכנון וייצור פשוטים יותר.מסיבות אלו, השימוש במבחנים דיגיטליים, במיוחד שיטות מבוססות טיפות, לאבחון מולקולרי, המשלב טכניקות הגברה וקריאת אותות, נחקר היטב במהלך ההתפרצות הקריטית של SARS-CoV-2.לדוגמה, Yin et al.[164] שילבו שיטות PCR דיגיטליות טיפות ומהירות כדי לזהות את הגנים ORF1ab, N ו-RNase P ב-SARS-CoV-2 בשבב מיקרופלואידי.יש לציין שהמערכת הצליחה לזהות אות חיובי תוך 115 שניות, שהוא מהיר יותר מ-PCR קונבנציונלי, מה שמצביע על יעילותו בזיהוי נקודת טיפול (איור 7א).דונג וחב'.[165], Sow et al.[157], חן ואח'.[166] ואלטרי ואח'.[167] החיל גם PCR דיגיטלי טיפה (ddPCR) כדי לזהות SARS-CoV-2 במערכת מיקרופלואידית עם תוצאות מרשימות.כדי לשפר עוד יותר את שיעור הגילוי, Shen et al.[168] השיג הדמיית שבב מבוסס ddPCR תוך 15 שניות בלבד ללא שימוש בטכניקות תפירת תמונה, מה שהאיץ את תהליך טכנולוגיית ddPCR ממעבדה ליישום.לא רק שיטות הגברה תרמיות כמו PCR מיושמות, אלא גם שיטות הגברה איזותרמיות משמשות כדי לפשט את תנאי התגובה ותגובה מהירה.לו וחב'.[71] פיתח את SlipChip לניתוח טיפות, המסוגל לייצר טיפות בגדלים שונים בצפיפות גבוהה בשלב אחד ולכמת חומצות גרעין SARS-CoV-2 באמצעות LAMP דיגיטלי (איור 7ב).כטכנולוגיה המתפתחת במהירות, CRISPR יכול גם למלא תפקיד חשוב בזיהוי חומצות גרעין דיגיטליות באמצעות הדמיה קולורימטרית נוחה ללא צורך בכתמי חומצה גרעין נוספים.אקרמן וחב'.פיתח תגובה מטריצת קומבינטורית להערכת מרובים של חומצות גרעין.[158] זיהה 169 וירוסים הקשורים לאדם, כולל SARS-CoV-2, בטיפות המכילות ריאגנטים לזיהוי חומצות גרעין מבוססות CRISPR-Cas13 במבחן microwell (איור 7c).בנוסף, ניתן להשתמש בהגברה איזותרמית וטכנולוגיית CRISPR באותה מערכת כדי לשלב את היתרונות של שניהם.פארק ואח'.[169] בדיקה דיגיטלית CRISPR/Cas12a פותחה בשבב מיקרו-נוזל מסחרי לזיהוי של SARS-CoV-2 שחולץ ומומת בחום מבוסס על RT-RPA חד-שלבי עם זיהוי אות לרקע קצר וגבוה יותר יחס זמן., טווח דינמי רחב יותר ורגישות טובה יותר (איור 7ד).כמה תיאורים של דוגמאות אלה מובאים בטבלה 3.
פלטפורמה דיגיטלית אופיינית לזיהוי חומצות גרעין.זרימת העבודה הדיגיטלית המהירה של PCR מורכבת מארבעה שלבים מרכזיים: הכנת דגימה, הפצת תערובת התגובה, תהליך הגברה וכימות יעד (מותאם מ-[164]).ב סכמטי המראה ניתוח של טיפות SlipChip להיווצרות טיפות בצפיפות גבוהה (מותאם מ-[71]).c דיאגרמת זרימת עבודה של CARMEN-Cas13 (מותאמת מ-[158]).ד סקירה כללית של זיהוי וירוסים דיגיטליים מתקדמים עם CRISPR/Cas בסיר אחד (מותאם מ-[169]).ללא מים בשמן, polydimethylsiloxane PDMS, PCR פולימראז תגובת שרשרת, איסוף נתונים DAQ, נגזרת אינטגרלית פרופורציונלית PID, תגובה מטריצת קומבינטורית של CARMEN להערכת חומצות גרעין מרובות, SARS-CoV-2, תסמונת נשימתית חריפה, נגיף קורונה 2, RT Amplification של Reverse transcriptase recombinase polymerase-RPA, אות S/B ברקע