תודה שביקרת ב-Nature.com.לגרסת הדפדפן שבה אתה משתמש יש תמיכת CSS מוגבלת.לקבלת החוויה הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או להשבית את מצב תאימות ב-Internet Explorer).בינתיים, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, נעבד את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
שיטות סימון קרבה אנזימטיות המבוססות על אסטרים פעילים או רדיקלים פנוקסיים נמצאים בשימוש נרחב למיפוי פרוטאומים תת-תאיים ואינטראקטיביים של חלבונים בתאים חיים.עם זאת, אסטרים מופעלים פחות תגובתיים, וכתוצאה מכך רדיוס תיוג רחב, ורדיקלים פנוקסיים הנוצרים על ידי טיפול בפרוקסיד יכולים להפריע למסלולי חיזור.כאן אנו מדווחים על שיטת פוטו-אקטיבציה תלויה תיוג קרבה (PDPL) שפותחה על ידי קישור גנטי של חלבון הפוטוסנסיטיזר מיניSOG לחלבון מעניין.מופעל על ידי אור כחול ונשלט על ידי זמן חשיפה, חמצן בודד נוצר ואז מושג סימון מרחבי-טמפורלי של שאריות היסטידין על ידי בדיקה אנילין.אנו מדגימים את הנאמנות הגבוהה שלו באמצעות מיפוי פרוטאום ספציפי לאברון.השוואה זה לצד זה של PDPL עם TurboID מראה כיסוי פרוטאומי ספציפי ומקיף יותר של PDPL.לאחר מכן, החלנו PDPL על גורם התעתוק הקשור למחלה BRD4 ו-E3 Parkin ligase ומצאנו גורמים אינטראקטיביים לא ידועים בעבר.על ידי בדיקת ביטוי יתר, זוהו שני מצעים לא ידועים, Ssu72 ו-SNW1, עבור פרקין, שההשפלה שלו מתווכת על ידי מסלול Ubiquitination-Proteasome.
אפיון מדויק של רשתות חלבון עומד בבסיס תהליכים תאיים בסיסיים רבים.לכן, מיפוי מרחבי-זמני מדויק ביותר של אינטראקציות חלבון יספק בסיס מולקולרי לפענוח מסלולים ביולוגיים, פתולוגיה של מחלות ושיבוש אינטראקציות אלו למטרות טיפוליות.לשם כך, רצוי מאוד שיטות המסוגלות לזהות אינטראקציות זמניות בתאים חיים או ברקמות.ספקטרומטריית מסה טיהור זיקה (AP-MS) שימשה באופן היסטורי לזיהוי שותפים מחייבים של חלבונים בעלי עניין (POI).עם פיתוח שיטות פרוטאומיקה כמותיות, נוצר Bioplex3.0, מסד הנתונים הגדול ביותר של רשתות חלבון המבוסס על AP-MS.למרות ש-AP-MS הוא חזק מאוד, שלבי תמוגה ודילול התא בזרימת העבודה מוטים לאינטראקציות מחייבות חלשות וחולפות ומציגים חפצים שלאחר הליזה כגון זוגות אינטראקציה מזויפת שחסרים מידור לפני התמוגה.
כדי לטפל בבעיות אלו, פותחו חומצות אמינו לא טבעיות (UAA) עם קבוצות צולבות ופלטפורמות תיוג אנזימטי בקרבת מקום (PL) (למשל APEX ו-BioID)5.למרות ששיטת UAA יושמה בהצלחה בתרחישים רבים ומספקת מידע על דבקי חלבון ישירים, עדיין נדרשת אופטימיזציה של אתר החדרת UAA.חשוב מכך, זוהי שיטת תיוג סטוכיומטרי שאין בה היפוך קטליטי של אירועי תיוג.לעומת זאת, שיטות PL אנזימטיות, כמו שיטת BioID, ממזגות את הביוטין ליגאז המהונדס ל-POI7, אשר מפעיל לאחר מכן את הביוטין ליצירת תוצר ביניים אסטר ביוטיניל-AMP תגובתי.האנזים מזרז ומשחרר "ענן" ביוטין פעיל המסמן שאריות ליזין פרוקסימליות.עם זאת, BioID דורש יותר מ-12 שעות כדי להשיג אות מסומן מספיק, אשר מונע את השימוש בו ברזולוציה זמנית.באמצעות אבולוציה מכוונת המבוססת על תצוגת שמרים, TurboID תוכנן על בסיס BioID להיות יעיל יותר, המאפשר תיוג יעיל עם ביוטין תוך 10 דקות, ומאפשר ללמוד תהליכים דינמיים יותר.מכיוון ש-TurboID פעיל מאוד ורמות ביוטין אנדוגניות מספיקות לתיוג ברמה נמוכה, תיוג רקע הופך לבעיה פוטנציאלית כאשר נדרש תיוג משופר מאוד ומתוזמן על ידי הוספת ביוטין אקסוגני.בנוסף, אסטרים מופעלים אינם בעלי תגובתיות נמוכה (t1/2 ~5 דקות), מה שעלול להוביל לרדיוס תיוג גדול, במיוחד לאחר רוויה של חלבונים שכנים עם ביוטין 5. בגישה אחרת, היתוך גנטי של אסקורבט פרוקסידאז מהונדס (כלומר ביוטין- רדיקלי פנול ומאפשר סימון חלבונים תוך דקה אחת.9,10. APEX נמצא בשימוש נרחב לזיהוי פרוטאומים תת-תאיים, קומפלקסים של חלבון ממברנה ומתחמי חלבון איתות ציטוסוליים.11,12 עם זאת, הצורך בריכוזים גבוהים של פרוקסידים יכול להשפיע על חלבוני חיזור או מסלולים, ולהפריע תהליכים תאיים.
לפיכך, שיטה חדשה המסוגלת ליצור מינים של דיכוי עם רדיוס מסומנים תגובתיים יותר עם דיוק מרחבי וזמני גבוה מבלי לשבש באופן משמעותי את המסלולים הסלולריים תהיה תוספת חשובה לשיטות הקיימות. בין המינים התגובתיים, חמצן יחיד עורר את תשומת לבנו בשל אורך חייו הקצר ורדיוס הדיפוזיה המוגבל (t1/2 < 0.6 מיקרון בתאים)13. בין המינים התגובתיים, חמצן יחיד עורר את תשומת לבנו בשל אורך חייו הקצר ורדיוס הדיפוזיה המוגבל (t1/2 < 0.6 מיקרון בתאים)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. בין הצורות הפעילות, חמצן בודד משך את תשומת הלב שלנו בשל אורך חייו הקצר ורדיוס הדיפוזיה המוגבל (t1/2 < 0.6 מיקרון בתאים)13.在 活性 物质 中 ， 单线 态氧因 态氧因 其 寿命 短 和 扩散 半径 有限 （细胞 中 t1/2 <0.6 μs） 而 引起 了 我们 的 13。 1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). בין צורות פעילות, חמצן יחיד מושך את תשומת הלב שלנו בגלל אורך חייו הקצר ורדיוס הדיפוזיה המוגבל (t1/2 < 0.6 μs בתאים).דווח כי חמצן בודד מחמצן באופן אקראי מתיונין, טירוזין, היסטידין וטריפטופן, מה שהופך אותו לקוטבי 14,15 להתקשרות לבדיקות מבוססות אמין או תיול16,17.למרות ששימש חמצן יחיד לתיוג RNA של תא תת-תאי, אסטרטגיות לשינוי ייעוד של סמני קירבה POI אנדוגניים נותרו בלתי נחקרות.כאן אנו מציגים פלטפורמה הנקראת תיוג קרבה תלוי בפוטואקטיבציה (PDPL), שבה אנו משתמשים באור כחול כדי להאיר נקודות עניין שהתמזגו עם מיני-SOG photosensitizer ולהפעיל יצירת חמצן יחיד לחמצון שאריות פרוקסימליות, ולאחר מכן שינויים המכילים אמינים לחמצון בדיקות כימיות לתוך תאים חיים ביניים..בדקנו קבוצה של בדיקות כימיות כדי למקסם את הספציפיות של התגים וזיהינו אתרי שינוי באמצעות זרימת עבודה פתוחה של פרוטאומיקה.השוואה זה לצד זה של PDPL עם TurboID מראה כיסוי פרוטאומי ספציפי ומקיף יותר של PDPL.יישמנו גישה זו על סמנים ספציפיים לאברונים של הפרוטום התת-תאי וזיהוי פרוטאום כללי של שותפים לקישור לחלבון הרגולטורי האפיגנטי הקשור לסרטן BRD4 ולליגאז E3 הקשור למחלת פרקינסון, אשר אישרו רשת ידועה ובלתי ידועה של חלבון. אינטראקציות..היכולת של PDPL לזהות מצעי E3 במתחמי חלבון גדולים מייצגת מצב שבו נדרשת הכרה של קושרים עקיפים.שני מצעי פרקין לא ידועים בתיווך Ubiquitination-Proteasome אושרו באתרם.
טיפול פוטודינמי (PDT)19 ואי-אקטיבציה בלייזר בסיוע כרומופור (CALI)20, שבו הקרנת אור עם חומרי רגישות פוטו יוצרת חמצן בודד, יכולה להשבית חלבוני מטרה או לגרום למוות של תאים.מכיוון שחמצן יחיד הוא חומר תגובתי מאוד עם מרחק דיפוזיה תיאורטי של כ-70 ננומטר, ניתן לשלוט בחמצון מוגבל מרחבית סביב הפוטוסנסיטיזר.בהתבסס על תפיסה זו, החלטנו להשתמש בחמצן בודד כדי להשיג תיוג קרוב של קומפלקסים חלבונים בתאים חיים.פיתחנו גישה כימופרוטאומית של PDPL למילוי ארבע פונקציות: (1) לזרז יצירת חמצן יחיד פעיל בדומה לגישה האנזימטית של PL;(2) לספק תיוג עם פתרון זמן עם התחלת האור;(3) על ידי שינוי (4) הימנע משימוש בקופקטורים אנדוגניים (כגון ביוטין) להפחתת הרקע, או השתמש בריאגנטים אקסוגניים מטרידים ביותר (כגון פרוקסידים) כדי למזער את חשיפת התא ללחץ סביבתי.
ניתן לחלק את רגישות האור לשתי קטגוריות כולל פלואורפורים במשקל מולקולרי קטן (למשל ורד בנגל, מתילן כחול)22 וחלבונים קטנים מקודדים גנטית (למשל miniSOG, KillerRed)23.כדי להשיג עיצוב מודולרי, פיתחנו את פלטפורמת ה-PDPL מהדור הראשון על ידי הוספת חלבוני פוטוסנסיטיזר (PS) ל-POI24,25 (איור 1א).כאשר הוא מוקרן באור כחול, חמצן יחיד מחמצן את שאריות חומצות אמינו נוקלאופיליות פרוקסימליות, וכתוצאה מכך קוטביות אמפולונג שהיא אלקטרופילית ויכולה להגיב עוד יותר עם נוקלאופילים של בדיקה אמינים16,17.הגשש מעוצב עם ידית אלקין כדי לאפשר כימיה של קליקים ומשיכה כלפי מטה לאפיון LC/MS/MS.
המחשה סכמטית של תיוג מתחמי חלבון בתיווך miniSOG.כאשר נחשפים לאור כחול, תאים המבטאים miniSOG-POI יוצרים חמצן יחיד, אשר משנה חלבונים המקיימים אינטראקציה אך לא חלבונים לא מחייבים.תוצרי ביניים של פוטואוקסידציה יורטים על ידי תוויות ממסר של הגשש הכימי אמין ליצירת אדדוקטים קוולנטיים.קבוצת האלקיניל בבדיקה הכימית מאפשרת כימיה של קליק להעשרה על ידי משיכה למטה ואחריה כימת LC-MS/MS.ב מבנה כימי של בדיקות אמינים 1-4.ג ניתוח ג'ל ניאון נציג של סמנים פרוטאומיים מתווכי מיני-SOG מקומיים במיטוכונדריה באמצעות בדיקות 1-4 וכימות יחסי המבוסס על דנסיטומטריית ג'ל.יחס האות לרקע של בדיקות כימיות הוערך באמצעות ניסויי בקרה שליליים ללא אור כחול או באמצעות תאי HEK293T ללא ביטוי miniSOG.n = 2 דגימות בלתי תלויות ביולוגית.כל נקודה מייצגת העתק ביולוגי.ד זיהוי וכימות נציג של PDPL באמצעות בדיקה אופטימלית 3 בנוכחות או היעדר רכיבי PDPL המצוינים כמו ג.n = 3 דגימות בלתי תלויות ביולוגית.כל נקודה מייצגת העתק ביולוגי.קווי מרכז ושפם מייצגים את הממוצע ו-± סטיית התקן.CBB: Coomassie Brilliant Blue.הדמיה קונפוקלית של חמצן יחיד עם כתם Si-DMA אדום רחוק.סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר.הדמיית ג'ל וניסויים קונפוקאליים חזרו באופן עצמאי לפחות פעמיים עם תוצאות דומות.
בדקנו לראשונה את יכולתם של חומרי הרגישות הבוגרים מיניSOG26 ו- KillerRed23, המתבטאים ביציבות ב-HEK293T, לתווך סימון פרופרגילמין של הפרוטאום כבדיקה כימית (איור משלים. 1a).ניתוח הקרינה של ג'ל הראה כי תיוג פרוטאום שלם הושג באמצעות miniSOG והקרנת אור כחול, בעוד שלא נצפה מוצר תיוג גלוי עם KillerRed.כדי לשפר את יחס האות לרקע, בדקנו קבוצה של בדיקות כימיות המכילות אנילין (1 ו-3), פרופילמין (2) או בנזילאמין (4).ראינו שלתאי HEK293T עצמם יש אות רקע גבוה יותר בהשוואה ללא אור כחול, אולי בגלל ה-Riboflavin Photosensitizer האנדוגני, flavin mononucleotide (FMN) 27. בדיקות כימיות מבוססות אנילין 1 ו-3 נתנו סגוליות טובה יותר, כאשר HEK293T מבטא ביציבות miniSOG במיטוכונדריה מציגה עלייה של פי 8 בסיגנל עבור בדיקה 3, בעוד שבדיקה 2 בשימוש בשיטת תיוג RNA CAP-seq מציגה רק ~2.5- עליית אות פיפול, ככל הנראה בשל העדפות תגובתיות שונות בין RNA וחלבון (איור 1b, ג). בדיקות כימיות מבוססות אנילין 1 ו-3 נתנו סגוליות טובה יותר, כאשר HEK293T מבטא ביציבות miniSOG במיטוכונדריה מציגה עלייה של פי 8 בסיגנל עבור בדיקה 3, בעוד שבדיקה 2 בשימוש בשיטת תיוג RNA CAP-seq מציגה רק ~2.5- עליית אות פיפול, ככל הנראה בשל העדפות תגובתיות שונות בין RNA וחלבון (איור 1b, ג).בדיקות כימיות מבוססות אנילין 1 ו-3 הראו סגוליות טובה יותר: HEK293T, המבטא ביציבות miniSOG במיטוכונדריה, מראה עלייה של יותר מפי 8 בסיגנל עבור בדיקה 3, בעוד שבדיקה 2, בשימוש בשיטת תיוג RNA CAP-seq, רק מראה עלייה של פי 2.5 אות, כנראה בגלל העדפות תגובתיות שונות בין RNA לחלבון (איור 1b, c).V 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， Hek293t 在 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 增加 增加 增加> 8 倍 而 于 于 rna 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2.5 -倍信号增加，可能是由于RNAבדיקה כימית מבוססת אנילין 1 ו-3 הייתה בעלת סגוליות טובה יותר, HEK293T ביטא ביציבות מיניSOG במיטוכונדריה, ולבדיקה 3 הייתה עלייה של פי 8 בסיגנל, בעוד שבדיקה 2 עבור שיטת תיוג RNA CAP-seq הראתה עלייה של פי 2.5 בלבד.באות, כנראה בשל העדפות תגובה שונות בין RNA לחלבון (איור 1b, c).בנוסף, נבדקו איזומרים של בדיקה 3 ובדיקות הידרזין (בדיקות 5, 6, 7), אשר מאשרות את האופטימיזציה של בדיקה 3 (איור משלים. 1b,c).באופן דומה, ניתוח הקרינה בג'ל גילה פרמטרים ניסויים אופטימליים אחרים: אורך גל הקרנה (460 ננומטר), ריכוז בדיקה כימית (1 מ"מ) וזמן הקרנה (20 דקות) (איור משלים. 2a-c).השמטת כל רכיב או שלב בפרוטוקול PDPL הובילה להיפוך אות משמעותי לרקע (איור 1ד).יש לציין כי סימון החלבון הצטמצם באופן משמעותי בנוכחות נתרן אזיד או טרולוקס, הידועים כמכבים חמצן בודד.הנוכחות של D2O, הידוע כמייצב חמצן בודד, משפרת את אות התיוג.כדי לחקור את התרומה של מיני חמצן תגובתיים אחרים לתיוג, נוספו מניטול וויטמין C כדי לבסס סורקי רדיקלים של הידרוקסיל וסופראוקסיד, בהתאמה, 18, 29, אך הם לא נמצאו כמפחיתים את הסימון.הוספת H2O2, אך לא הארה, לא הביאה לתיוג (איור משלים. 3a).הדמיית חמצן פלואורסצנטית עם בדיקות Si-DMA אישרה את נוכחותו של חמצן בודד בחוט HEK293T-miniSOG, אך לא בחוט HEK293T המקורי.בנוסף, mitoSOX Red לא הצליח לזהות ייצור סופראוקסיד לאחר הארה (איור 1e ואיור משלים. 3b) 30. נתונים אלה מרמזים מאוד על כך שחמצן יחיד הוא סוג החמצן התגובתי העיקרי האחראי לתיוג הפרוטאומי הבא.ציטוטוקסיות של PDPL הוערכה כולל הקרנת אור כחול ובדיקות כימיות, ולא נצפתה ציטוטוקסיות משמעותית (איור משלים. 4a).
על מנת לחקור את מנגנון התיוג ולאפשר זיהוי פרוטאומי של מתחמי חלבון באמצעות LC-MS/MS, ראשית עלינו לקבוע אילו חומצות אמינו משתנות ואת מסת הדלתא של תוויות בדיקה.דווח כי מתיונין, היסטידין, טריפטופן וטירוזין השתנו על ידי חמצן בודד14,15.אנו משלבים את זרימת העבודה של TOP-ABPP31 עם החיפוש הפתוח והבלתי משוחד המסופק על ידי פלטפורמת המחשוב FragPipe המבוססת על MSFragger32.לאחר שינוי חמצן יחיד ותיוג בדיקה כימית, בוצעה כימיה של קליק באמצעות תווית הפחתת ביוטין המכילה מקשר הניתן לפירוק, ולאחריה מתיחת נויטרווידין ועיכול טריפסין.הפפטיד המותאם, שעדיין קשור לשרף, נחתך בצילום לניתוח LC-MS/MS (איור 2א ונתונים משלימים 1).מספר רב של שינויים התרחשו לאורך הפרוטאומה עם למעלה מ-50 התאמות של מפות פפטידים (PSM) המפורטות (איור 2ב).באופן מפתיע, ראינו רק שינוי של היסטידין, כנראה בגלל התגובתיות הגבוהה יותר של היסטידין מחומצן כלפי בדיקות אנילין מאשר חומצות אמינו אחרות.על פי המנגנון שפורסם של חמצון היסטידין על ידי חמצן בודד,21,33 המבנה המוצע של מסה דלתא של +229 Da מתאים לתוספת של בדיקה 3 עם 2-oxo-Histidine לאחר שני חמצון, בעוד +247 Da הוא תוצר ההידרוליזה של +229 דא (איור משלים 5).הערכת ספקטרום MS2 הראתה מהימנות גבוהה של זיהוי של רוב יוני y ו-b, כולל זיהוי של יוני קטע שונה (y ו-b) (איור 2c).ניתוח הקשר של הרצף המקומי של היסטידינים שעברו שינוי ב-PDPL גילה העדפת מוטיב מתונה לשאריות הידרופוביות קטנות במיקום ±1 (איור משלים 4b).בממוצע, 1.4 היסטידינים זוהו לחלבון, והאתרים של סמנים אלו נקבעו על ידי שטח פנים נגיש לממס (SASA) וניתוח זמינות ממס יחסית (RSA) (איור משלים. 4c,d).
זרימת עבודה בלתי משוחדת ללימוד סלקטיביות שיורית באמצעות פלטפורמת המחשוב FragPipe המופעלת על ידי MSFragger.קישורים ניתנים לביקוע משמשים בכימיה של קליק כדי לאפשר פיצול צילום של פפטידים שעברו שינוי משרף streptavidin.הושק חיפוש פתוח כדי לזהות שינויים רבים, כמו גם שרידים רלוונטיים.ב הקצה את מסת השינויים המתרחשים בכל הפרוטאומה.מיפוי פפטיד PSM.c ביאור ספקטרלי MS2 של אתרי היסטידין ששונו עם בדיקה 3. כדוגמה מייצגת, תגובה קוולנטית עם בדיקה 3 הוסיפה +229.0938 Da לחומצת האמינו המשתנה.ד מבחן מוטציה המשמש לבדיקת סמני PDPL.PRDX3 (H155A, H225A) ו-PRDX1 (H10A, H81A, H169A) הועברו עם פלסמידים מסוג פרא לזיהוי אנטי-דגל.הפפטיד הסינטטי הגיב עם miniSOG מטוהר בנוכחות בדיקה 3 והמוצרים המתאימים עם Δm +247 ו-+229 צוינו בספקטרום LC-MS.ו אינטראקציות חלבון לחלבון במבחנה במודל עם miniSOG-6xHis-tag ו-anti-6xHis נוגדן.אנטיביוטין (streptavidin-HRP) ואנטי-עכבר ניתוח Western blot של קומפלקסים של נוגדנים miniSOG-6xHis/anti-6xHis המסומנים ב-probe 3, בהתאם לזמן החשיפה לאור.התוויות לחלבונים בודדים מתבטאות במשקל המולקולרי המתאים: LC antibody chain, HC antibody chain.ניסויים אלו חזרו באופן עצמאי לפחות פעמיים עם תוצאות דומות.
לצורך אימות ביוכימי של אתר התיוג, PRDX3 ו-PRDX1 שזוהו באמצעות ספקטרומטריית מסה שונו מהיסטידין לאלנין והשוו לסוג הבר במבחני טרנספקציה.תוצאות ה-PDPL הראו שהמוטציה הפחיתה באופן משמעותי את התיוג (איור 2ד).בינתיים, רצפי הפפטידים שזוהו בחיפוש הפתוח סונתזו והגיבו במבחנה עם miniSOG מטוהר בנוכחות בדיקה 3 ואור כחול, והניבו מוצרים עם הסטת מסה של +247 ו-+229 Da כאשר זוהו על ידי LC-MS (איור .2ה).).כדי לבדוק האם ניתן לתייג חלבונים פרוקסימליים בעלי אינטראקציה במבחנה בתגובה ל-miniSOG photoactivation, תכננו בדיקת קרבה מלאכותית על ידי אינטראקציה בין חלבון miniSOG-6xHis לנוגדן חד שבטי אנטי-His במבחנה (איור 2f).בבדיקה זו, ציפינו לתיוג פרוקסימלי של שרשראות כבדות וקלות של נוגדנים עם miniSOG.למעשה, אנטי-עכבר (זיהה את השרשרות הכבדות והקלות של נוגדן אנטי-6xHis המסומן) וכתמי סטרפטאבידין המערבי הראו ביוטינילציה חזקה של השרשרת הכבדה והקלה.יש לציין, שמנו לב לאובוביוטינילציה של miniSOG עקב תג 6xHis וקשרים צולבים בין שרשראות קלות וכבדות, אשר עשוי להיות קשור לפער שתואר קודם לכן בין התגובה הפרוקסימלית של ליזין ל-2-oxo-histidine.לסיכום, אנו מסיקים כי PDPL משנה היסטידין באופן תלוי קרבה.
המטרה הבאה שלנו הייתה לאפיין את הפרוטאום התת תאי כדי לבדוק את הספציפיות של תיוג באתרו.לכן, ביטאנו מיניSOG ביציבות בגרעין, במטריקס המיטוכונדריאלי או בממברנת ה-ER החיצונית של תאי HEK293T (איור 3א).ניתוח הקרינה של ג'ל גילה להקות מסומנות בשפע בשלושה מיקומים תת-תאיים וכן דפוסי תיוג שונים (איור 3b).ניתוח הדמיית פלואורסצנטי הראה ספציפיות גבוהה של PDPL (איור 3c).לאחר זרימת העבודה של PDPL נרשמו תגובות קליקים עם צבעי rhodamine כדי לשרטט פרוטאומים תת-תאיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ואותות PDPL בוצעו יחד עם DAPI, מעקבים מיטוכונדריאליים או ER trackers, המאשרים את הנאמנות הגבוהה של PDPL.עבור שלושת מיקומי האברונים, השוואה זה לצד זה של PDPL עם TurboID באמצעות אבידין ווסטרן כתם הראתה ש-PDPL סומן באופן ספציפי יותר בהשוואה לבקרות שלהם.בתנאי PDPL, הופיעו להקות מסווגות יותר, מה שמצביע על יותר חלבונים המסומנים ב-PDPL (איור משלים. 6a-d).
ייצוג סכמטי של תיוג פרוטאום ספציפי בתיווך miniSOG.miniSOG ממקד את המטריצה המיטוכונדריאלית באמצעות היתוך ל-23 חומצות האמינו ה-N-טרמינליות של COX4 אנושי (mito-miniSOG), הגרעין באמצעות היתוך ל-H2B (nucleus-miniSOG), ו-Sec61β דרך הצד הציטופלזמי של ממברנת ה-ER (ER-miniSOG) ).האינדיקציות כוללות הדמיית ג'ל, הדמיה קונפוקלית וספקטרומטריית מסה.ב תמונות ג'ל מייצגות של שלושה פרופילי PDPL ספציפיים לאברונים.CBB Coomassie Brilliant Blue.ג תמונות קונפוקאליות מייצגות של תאי HEK293T המבטאים ביציבות miniSOG עם לוקליזציות תת-תאיות שונות שזוהו על ידי נוגדן שסומן V5 (אדום).סמנים תת-תאיים משמשים למיטוכונדריה ול-ER (ירוק).זרימת העבודה של PDPL כוללת זיהוי של פרוטאומים תת-תאיים המסומנים ב-miniSOG (צהוב) באמצעות כימיה של Cy3-azide Click.סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר.ד חלקות געשיות של פרוטאומים מתויגים ב-PDPL באברונים שונים שנכמתו על ידי כימות לא מסומן (n = 3 ניסויים ביולוגיים עצמאיים).מבחן t של סטודנט דו-זנבי שימש בחלקות הר געש.סוג פרא HEK293T שימש כביקורת שלילית. חלבונים שהשתנו באופן משמעותי מודגשים באדום (p < 0.05 ו-> פי שניים הבדל בעוצמת היונים). חלבונים שהשתנו באופן משמעותי מודגשים באדום (p < 0.05 ו-> פי שניים הבדל בעוצמת היונים). Значительно изменные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). חלבונים שהשתנו באופן משמעותי מודגשים באדום (p < 0.05 והבדל של פי 2 בעוצמת היונים).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). חלבונים שהשתנו באופן משמעותי מודגשים באדום (p < 0.05 ו-> הבדל של פי 2 בחוזק יוני).חלבונים קשורים שחשובים עבור HEK293T-miniSOG אך לא חשובים עבור HEK293T מוצגים בירוק.ה ניתוח הספציפיות של מערכי נתונים פרוטאומיים מניסויים ד.המספר הכולל של חלבונים מובהקים סטטיסטית בכל אברון (נקודות אדומות וירוקות) מסומן בחלק העליון.היסטוגרמות מציגות חלבונים הממוקמים באברונים על בסיס MitoCarta 3.0, ניתוח GO ו-A. Ting et al.אֲנָשִׁים.מערכי נתונים נפרדים למיטוכונדריה, גרעינים ו-ER.ניסויים אלו חזרו באופן עצמאי לפחות פעמיים עם תוצאות דומות.נתונים גולמיים מסופקים בצורה של קבצי נתונים גולמיים.
בעידוד תוצאות הג'ל וההדמיה, נעשה שימוש בכימות ללא תווית כדי לכמת את הפרוטאום שזוהה בכל אברון (נתונים משלימים 2).HEK293T לא עברה שימש כבקרה שלילית להפחתת סמני רקע. ניתוח עלילת הר געש הציג חלבונים מועשרים באופן משמעותי (p < 0.05 ועוצמת יונים פי 2) כמו גם חלבוני יחיד שנמצאים רק בקווים המבטאים miniSOG (איור 3d נקודות אדומות וירוקות). ניתוח עלילת הר געש הציג חלבונים מועשרים באופן משמעותי (p < 0.05 ועוצמת יונים פי 2) כמו גם חלבוני יחיד שנמצאים רק בקווים המבטאים miniSOG (איור 3d נקודות אדומות וירוקות). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). ניתוח עלילת הר געש הראה חלבונים מועשרים באופן משמעותי (p<0.05 ועוצמת יונים פי 2) כמו גם חלבונים בודדים שנמצאים רק בקווים המבטאים miniSOG (איור 3d, נקודות אדומות וירוקות).火山图 分析 显示 出 显着 富集 的 蛋白质 p火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （P <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 图 3d 红色 绿色点 。。。 Å Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). ניתוח עלילת הר געש גילה חלבונים מועשרים משמעותית (p<0.05 ו->2x חוזק יוני) וכן חלבונים בודדים הקיימים רק בקו הביטוי miniSOG (נקודות אדומות וירוקות באיור 3d).בשילוב נתונים אלה, זיהינו 1364, 461 ו-911 חלבונים גרעיניים, מיטוכונדריה ו-ER ממברנה חיצונית בעלי משמעות סטטיסטית, בהתאמה.כדי לנתח את הדיוק של PDPL הממוקם באברונים, השתמשנו ב-MitoCarta 3.0, בניתוח Gene Ontology (GO) וב-A. Ting et al.ערכת נתונים8 שימשה עבור מיטוכונדריה, גרעין ו-ER כדי לבדוק את הספציפיות של האברונים של החלבונים שזוהו, המקבילה לדיוק של 73.4, 78.5 ו-73.0% (איור 3ה).הספציפיות של PDPL מאשרת ש-PDPL הוא כלי אידיאלי לזיהוי פרוטומים ספציפיים לאברונים.יש לציין כי ניתוח תת-מיטוכונדריאלי של חלבוני מיטוכונדריאלי מזוהים הראה שהפרוטאום הכלוא הופץ בעיקר במטריצה ובקרום הפנימי (226 ו-106, בהתאמה), ומהווה 91.7% (362) מהמספר הכולל של חלבונים מיטוכונדריאליים שזוהו.רמה גבוהה של PDPL אושרה בנוסף (איור משלים. 7a).באופן דומה, ניתוח תת-גרעיני הראה שהפרוטאום שנלכד היה מופץ בעיקר בגרעין, בנוקלאופלזמה ובגרעין (איור משלים 7b).ניתוח פרוטאומי גרעיני עם פפטיד אות לוקליזציה גרעיני (3xNLS) הראה דיוק דומה למבנה H2B (איור משלים. 7c-h).כדי לקבוע את הספציפיות של סמן ה-PDPL, למינין A גרעיני נבחר כמלכודת POI7 מקומית באופן דיסקרטי יותר.PDPL זיהה 36 חלבונים מועשרים באופן משמעותי, מתוכם 12 חלבונים (30.0% כולל lamin A) היו חלבונים בעלי אינטראקציה עם lamin A מאופיינים היטב על ידי מסד הנתונים של String, עם אחוז גבוה יותר משיטת BioID (122 חלבונים) 28 מתוך 28. , 22.9 %) 7. השיטה שלנו זיהתה פחות חלבונים, אולי בגלל אזורי תיוג מוגבלים, שהתאפשרה על ידי חמצן בודד יותר פעיל.ניתוח GO הראה שהחלבונים שזוהו היו ממוקמים בעיקר בנוקלאופלזמה (26), קרום גרעיני (10), קרום גרעיני (9) ונקבוביות גרעיניות (5).ביחד, החלבונים הממוקמים בגרעין היוו 80% מהחלבונים המועשרים, מה שממחיש עוד יותר את הספציפיות של PDPL (איור משלים. 8a-d).
לאחר שביססנו את היכולת של PDPL לבצע סימון קרבה באברונים, לאחר מכן בדקנו האם ניתן להשתמש ב-PDPL לניתוח שותפים מחייבים ל-POI.בפרט, ביקשנו להגדיר ניתוח PDPL של חלבונים ציטוסוליים, הנחשבים למטרות קשות יותר מעמיתיהם הממוקמים בממברנה בשל אופיים הדינמי מאוד.החלבון bromodomain והאקסטרה-טרמינלי (BET) BRD4 משך את תשומת הלב שלנו בשל תפקידו המרכזי במחלות שונות 35, 36.הקומפלקס שנוצר על ידי BRD4 הוא קו-פעיל תעתיק ומטרה טיפולית חשובה.על ידי ויסות הביטוי של גורמי שעתוק c-myc ו-Wnt5a, נחשב BRD4 כגורם מרכזי ללוקמיה מיאלואידית חריפה (AML), מיאלומה נפוצה, לימפומה של Burkitt, סרטן המעי הגס ומחלות דלקתיות37,38.בנוסף, נגיפים מסוימים מכוונים ל-BRD4 כדי לווסת את התעתוק הנגיפי והתאי, כמו וירוס הפפילומה, HIV ו-SARS-CoV-236,39.
כדי למפות את האינטראקציה של BRD4 באמצעות PDPL, שילבנו את miniSOG עם איזופורם N- או C-טרמינלי קצר של BRD4.תוצאות פרוטאומיות גילו רמה גבוהה של חפיפה בין שני המבנים (איור משלים. 9a).הפרוטאום הגרעיני המזוהה עם miniSOG-H2B מכסה 77.6% מהחלבונים המקיימים אינטראקציה עם BRD4 (איור משלים. 9b).לאחר מכן, זמני הארה שונים (2, 5, 10, 20 דקות) שימשו כדי להתאים את רדיוס הסמן (איור 4א ונתונים משלימים 3).אנו מסיקים כי בתקופות צילום קצרות יותר, PDPL יסמן בעיקר שותפים לקישור ישיר, בעוד שתקופות ארוכות יותר יכללו חלבונים שזוהו במהלך תקופות פוטו-אקטיבציה קצרות יותר וכן מטרות עקיפות בקומפלקסים של תיוג.למעשה, מצאנו חפיפה חזקה בין נקודות זמן סמוכות (84.6% עבור 2 ו-5 דקות; 87.7% עבור 5 ו-10 דקות; 98.7% עבור 10 ו-20 דקות) (איור 4b ואיור משלים. 9c).בכל קבוצות הניסוי, מצאנו לא רק תיוג עצמי של BRD4, אלא מספר יעדים ידועים כגון MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A ו-HMGB1 המובאים במסד הנתונים של המחרוזות.החוזק היוני של מטרות אלה הוא פרופורציונלי לזמן החשיפה (איור 4c ואיור משלים 9d).ניתוח GO של החלבונים שזוהו בקבוצה של 2 דקות הראה שהחלבונים שזוהו היו מקומיים בגרעין והיו מעורבים בעיצוב מחדש של כרומטין ותפקוד RNA פולימראז.התפקוד המולקולרי של החלבון הועשר בקשירה לכרומטין או בשיתוף תעתיק, בהתאם לתפקוד BRD4 (איור 4ד).ניתוח אינטראקציית חלבון התומכת במסד נתונים חשף רמה ראשונה של אינטראקציות עקיפות בין מתחמי אינטראקציה ממשפחת BRD4 ו-HDAC כגון SIN3A, NCOR2, BCOR ו-SAP130 (איור 4e ואיור משלים. 9e), בקנה אחד עם היסטונים אצטילטים קושרים ל-BRD4 ו-HDAC ..בנוסף, מטרות מייצגות שזוהו על ידי LC-MS/MS, כולל Sin3A, NSUN2, Fus ו-SFPQ, אושרו על ידי סופג מערבי (איור 4f).לאחרונה, דווח שהאיזופורם הקצר של BRD4 יוצר גרעינים בעלי תכונות הפרדת פאזה נוזל-נוזל (LLPS).החלבונים קושרים ל-RNA Fus ו-SFPQ מתווכים את ה-LLPS של תהליכים תאיים שונים וזוהו כאן כחלבוני קושרי BRD4 לא רשומים.האינטראקציה בין BRD4 ל-SFPQ אושרה על ידי ניסויים של שיתוף אימונו-פריפציטציה (קו-IP) (איור 4g), מה שמצביע על מנגנון נוסף להפרדת פאזות נוזל-נוזל בתיווך BRD4 הראוי לחקירה נוספת.יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך ש-PDPL היא פלטפורמה אידיאלית לזיהוי חלבונים מחייבים ידועים באינטראקציה עם BRD4 כמו גם לא ידועים.
ייצוג סכמטי של סימון קרבה מסוג BRD4 בתיווך miniSOG, זמני חשיפה: 2, 5, 10 ו-20 דקות.ב חפיפה של חלבונים שזוהו בזמני הארה שונים.העשרת חלבון שזוהתה ב-HEK293T-miniSOG-BRD4 הייתה מובהקת סטטיסטית בהשוואה ל-HEK293T מסוג פרא.ג עוצמת יונים בעת כימת חלבונים ידועים מייצגים ללא תווית BRD4 במהלך זמן החשיפה שצוין.n = 3 דגימות בלתי תלויות ביולוגית.הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן.ד אנליזה גנטית אונטולוגית (GO) של חלבונים שזוהו בקבוצה של 2 דקות.עשרת המונחים הראשונים של GO מפורטים.הבועות נצבעות לפי קטגוריית המונחים GO, וגודל הבועות הוא פרופורציונלי למספר החלבונים שנמצאים בכל מונח.e ניתוח מחרוזת של חלבונים באינטראקציה עם BRD4.העיגולים הצהובים הם דבק ישיר והעיגולים האפורים הם השכבה הראשונה של דבק עקיף.הקווים האדומים מייצגים את האינטראקציות שנקבעו בניסוי והקווים הכחולים מייצגים את האינטראקציות החזויות.מטרות מחייבות BRD4 נציגות שזוהו ב-LC-MS/MS אומתו על ידי Western blotting.g ניסויים של שילוב אימוניות מאשרים את האינטראקציה בין SFPQ ל-BRD4.ניסויים אלו חזרו באופן עצמאי לפחות פעמיים עם תוצאות דומות.נתונים גולמיים מסופקים בצורה של קבצי נתונים גולמיים.
בנוסף לזיהוי יעדים לא רשומים הקשורים ל-POI, אנו משערים ש-PDPL יתאים לזיהוי מצעים לאנזימים, מה שידרוש אפיון של חלבוני קושרים עקיפים בקומפלקסים גדולים כדי להעיר מצעים לא רשומים.פרקין (מקודד על ידי PARK2) הוא ליגאז E3 וידוע כי מוטציות בפארקין גורמות למחלת פרקינסון נעורים אוטוזומלית רצסיבית (AR-JP)42.בנוסף, פרקין תואר כחיוני למיטופגיה (אוטופגיה מיטוכונדריאלית) ולהסרה של מיני חמצן תגובתיים.עם זאת, למרות שזוהו מספר מצעי פרקין, תפקידו של פרקין במחלה זו נותר לא ברור.כדי להוסיף הערות למצעים הלא מאופיינים שלו, PDPL נבדק על ידי הוספת miniSOG ל-N- או C-terminus של פרקין.תאים טופלו ב-Carbonyl Cyanide Proton Transporter m-chlorophenylhydrazone (CCCP) כדי להפעיל פרקין דרך מסלול PINK1-Parkin.בהשוואה לתוצאות ה-BRD4 PDPL שלנו, היתוך N-terminus של פרקין חשף קבוצה גדולה יותר של חלבוני מטרה, למרות שכיסה חלק גדול יותר מה-C-terminus (177 מתוך 210) (איור 5a,b ונתונים משלימים 4).התוצאה עולה בקנה אחד עם דיווחים לפיהם תגיות N-טרמינליות יכולות להפעיל באופן חריג את פרקין44.באופן מפתיע, היו רק 18 חלבונים חופפים בנתונים שלנו עם תוצאות AP-MS שפורסמו עבור Parkin43, ככל הנראה בגלל הבדלים בין שורות תאים וזרימות עבודה של פרוטאומיקה.בנוסף לארבעה חלבונים ידועים (ARDM1, HSPA8, PSMD14 ו-PSMC3) שזוהו בשתי שיטות (איור 5c)43.כדי לאמת עוד יותר את התוצאות של LC-MS/MS, נעשה שימוש בטיפול PDPL ובעקבותיו ב-Western blotting כדי להשוות את התוצאות של בדיקת תאי האב HEK293T וקו הפארקין היציב N-terminal.יעדים לא ידועים בעבר CDK2, DUT, CTBP1 ו-PSMC4 נבדקו עם מקשר ידוע, DNAJB1 (איור 5ד).
חלקת הר געש של חלבונים בעלי אינטראקציה עם פרקין בתאי HEK293T עם miniSOG מבוטא באופן יציב שהתמזג לקצה N או C של פרקין (n = 3 ניסויים ביולוגיים בלתי תלויים).מבחן t של סטודנט דו-זנבי שימש בחלקות הר געש.HEK293T שימש כבקרה שלילית. חלבונים שהשתנו באופן משמעותי מודגשים באדום (p < 0.05 ו-> פי שניים הבדל בעוצמת היונים). חלבונים שהשתנו באופן משמעותי מודגשים באדום (p < 0.05 ו-> פי שניים הבדל בעוצמת היונים). Значительно изменные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). חלבונים שהשתנו באופן משמעותי מודגשים באדום (p < 0.05 והבדל של פי 2 בעוצמת היונים).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). חלבונים שהשתנו באופן משמעותי מודגשים באדום (p < 0.05 ו-> הבדל של פי 2 בחוזק יוני).חלבונים קשורים שחשובים עבור HEK293T-miniSOG אך לא חשובים עבור HEK293T מוצגים בירוק.b דיאגרמת Venn המציגה חלבונים חופפים בין מבנים N-טרמינליים ו-C-טרמינליים.תגיות N-טרמינליות יכולות להפעיל באופן חריג את פרקין ולגרום לחלבונים מזוהים יותר.c דיאגרמת Venn המציגה חלבונים חופפים בין PDPL ו-AP-MS.גורמים אינטראקטיביים ידועים מפורטים, כולל 4 מתוך 18 חלבונים חופפים ו-11 מתוך 159 חלבונים שזוהו ספציפית ב-PDPL.ד יעדים מייצגים שזוהו על ידי LC-MS/MS אומתו על ידי Western blotting.e Ssu72 ו-SNW1 זוהו כמצעי פרקין לא רשומים.פלסמידים חלבוניים מתויגי FLAG אלו הועברו ל-HEK293T ו-HEK293T-Parkin-miniSOG ולאחר מכן טיפול ב-CCCP בנקודות זמן שונות.השפלה הייתה בולטת יותר בקו ביטוי היתר של פרקין.f באמצעות מעכב הפרוטאזום MG132, אושר שתהליך הפירוק של Ssu72 ו-SNW1 מתווך על ידי פרוטאזום-יוביקוויטינציה.ניסויים אלו חזרו באופן עצמאי לפחות פעמיים עם תוצאות דומות.נתונים גולמיים מסופקים בצורה של קבצי נתונים גולמיים.
יש לציין שהחלבונים שזוהו על ידי PDPL חייבים לכלול חלבונים קושרי פרקין והמצעים שלהם.כדי לזהות מצעי פרקין לא רשומים, בחרנו שבעה חלבונים מזוהים (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 ו-SNW1) ופלסמידים שעברו טרנספקט כדי לחשוף את הגנים הללו ל-HEK293T נורמלי ולבטא באופן יציב את הטיפול ב-miniSOG-Parkin שלאחריו HEK293T.הרמות של חלבוני Ssu72 ו-SNW1 הופחתו באופן משמעותי בקו ה-miniSOG-Parkin היציב (איור 5ה).טיפול ב-CCCP במשך 12 שעות הביא לפירוק המשמעותי ביותר של שני המצעים.כדי לחקור האם הפירוק של Ssu72 ו-SNW1 מווסת על ידי פרוטאזום-יוביקוויטינציה, הוסף מעכב הפרוטאזום MG132 כדי לעכב את פעילות הפרוטאזום, ולמעשה מצאנו שתהליך הפירוק שלהם היה מעוכב (איור 5ו).מטרות נוספות שאינן מצע אושרו כאינטראקקטורים של פרקין באמצעות Western blotting (איור משלים. 10), שהראה תוצאות עקביות עם LC-MS/MS.לסיכום, השילוב של זרימת העבודה של PDPL עם אימות העברת חלבון מטרה מאפשר זיהוי של מצעי ליגאז E3 לא רשומים.
פיתחנו פלטפורמת סימון קרבה משותפת המאפשרת לך לזהות במרחב ובזמן נקודות עניין מתקשרות.הפלטפורמה מבוססת על חלבון ה-Photosensitizer miniSOG, שהוא רק כ-12 kDa, פחות ממחצית הגודל של האנזים הבוגר APEX2 (27 kDa) ושליש מגודלו של TurboID (35 kDa).הגודל הקטן יותר אמור להרחיב מאוד את מגוון היישומים לחקר אינטראקטומי חלבון קטנים.יש צורך בחקירה נוספת של חומרים רגישים נוספים, בין אם חלבונים מקודדים גנטית או מולקולות קטנות, כדי להגדיל את התפוקה הקוונטית של חמצן בודד ולהרחיב את הרגישות של גישה זו.עבור הגרסה הנוכחית של miniSOG, ניתן להשיג רזולוציה זמנית גבוהה באמצעות תאורה כחולה להפעלת סמני קרבה.בנוסף, זמן חשיפה ארוך יותר שיחרר "ענן" גדול יותר של חמצן בודד, וכתוצאה מכך שינוי של שאריות היסטידין יותר מרוחקות, הגדלת רדיוס התיוג והיכולת לכוונן את הרזולוציה המרחבית של PDPL.בדקנו גם שבעה בדיקות כימיות כדי להגדיל את יחס האות לרקע וחקרנו את המנגנון המולקולרי מאחורי גישה זו.זרימת העבודה של TOP-ABPP בשילוב עם חיפוש פתוח ללא משוא פנים אישרו ששינויים התרחשו רק בהיסטידינים ולא נצפתה מיקרו-סביבה עקבית לשינויים מוגברים בהיסטידין, למעט העדפה מתונה להיסטידינים באזור הלולאה.
PDPL שימש גם לאפיון פרוטומים תת-תאיים עם סגוליות וכיסוי פרוטאומים הדומים לפחות לתיוג קרבה אחר ושיטות בדיקה כימיות ספציפיות לאברונים.סמני קרבה שימשו בהצלחה גם לאפיון הפרוטאומים פני השטח, הליזוזומליים והפרוטומים הקשורים להפרשה46,47.אנו מאמינים ש-PDPL יהיה תואם לאברונים התת-תאיים הללו.בנוסף, קראנו תיגר על PDPL על ידי זיהוי יעדים לקשירת חלבון ציטוזולי שהם מורכבים יותר מחלבונים הקשורים לממברנה בשל התכונות הדינמיות שלהם ומעורבותם באינטראקציות זמניות יותר.PDPL הוחל על שני חלבונים, ה-Coactivator Coactivator BRD4 והליגאז E3 Parkin הקשור למחלה.שני חלבונים אלה נבחרו לא רק בשל הפונקציות הביולוגיות הבסיסיות שלהם, אלא גם בשל הרלוונטיות הקלינית והפוטנציאל הטיפולי שלהם.עבור שני נקודות עניין אלה, זוהו שותפים מחייבים ידועים וכן יעדים לא רשומים.יש לציין כי החלבון SFPQ הקשור להפרדת פאזות אושר על ידי co-IP, מה שעשוי להצביע על מנגנון חדש שבאמצעותו BRD4 (איזופורם קצר) מווסת LLPS.יחד עם זאת, אנו מאמינים כי זיהוי מצעי פרקין הינו תרחיש בו נדרש זיהוי של דבקים עקיפים.זיהינו שני מצעי פרקין לא מזוהים ואישרנו את השפלתם לאורך מסלול Ubiquitination-Proteasome.לאחרונה פותחה אסטרטגיית לכידה מבוססת מנגנון לזיהוי מצעי הידרולאז על ידי לכידתם באמצעות אנזימים.למרות שמדובר בשיטה חזקה מאוד, היא אינה מתאימה לניתוח של מצעים המעורבים ביצירת קומפלקסים גדולים ומצריכה יצירת קשרים קוולנטיים בין האנזים למצע.אנו מצפים שניתן להרחיב את PDPL לחקר קומפלקסים חלבונים אחרים ומשפחות אנזימים, כגון משפחות ה-deubiquitinase ו-metalloprotease.
צורה חדשה של miniSOG, הנקראת SOPP3, פותחה עם ייצור חמצן בודד משופר.השווינו את miniSOG עם SOPP3 ומצאנו ביצועי סימון משופרים, אם כי יחס האות לרעש נותר ללא שינוי (איור משלים. 11).שיערנו שאופטימיזציה של SOPP3 (למשל, באמצעות אבולוציה מכוונת) תוביל לחלבוני פוטוסנסיטיזר יעילים יותר הדורשים זמני אור קצרים יותר ובכך יאפשרו לכידת תהליכים תאיים דינמיים יותר.יש לציין שהגרסה הנוכחית של PDPL מוגבלת לסביבה התאית מכיוון שהיא דורשת תאורה של אור כחול ואינה יכולה לחדור לרקמות עמוקות.תכונה זו מונעת את השימוש בה במחקרי מודלים של בעלי חיים.עם זאת, השילוב של אופטוגנטיקה עם PDPL יכול לספק הזדמנות למחקר בבעלי חיים, במיוחד במוח.בנוסף, חומרי רגישות אינפרא אדום מהונדסים אחרים מסירים גם מגבלה זו.מחקר מתנהל כיום בתחום זה.
קו התאים HEK293T התקבל מ-ATCC (CRL-3216).קו התאים נבדק שלילי לזיהום ב-mycoplasma ותופח ב-DMEM (Thermo, #C11995500BT) בתוספת של 10% סרום בקר עוברי (FBS, Vistech, #SE100-B) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין (Hyclone, #SV30010).גדל ב.
3-Aminophenylene (דגימה 3) ו-(4-ethynylphenyl)methanamine (דגימה 4) נרכשו מ- Bidepharm.פרופילמין (בדיקה 2) נרכש מ-Energy-chemicals.N-(2-Aminophenyl)pent-4-ynamide (בדיקה 1) סונתז על פי שיטות שפורסמו.
טבלה משלימה 1 מפרטת את המבנים הגנטיים שבהם נעשה שימוש במחקר זה.רצפי ה-miniSOG וה- KillerRed שובטו מפלסמיד מתנה מ-P. Zou (אוניברסיטת פקינג).רצף המיקוד של המטריצה המיטוכונדריאלית נגזר מ-23 חומצות האמינו הטרמינליות של COX4 ושובט לווקטורים המצוינים באמצעות מכלול גיבסון (Beyotime, #D7010S).כדי למקד את הממברנה והגרעין של הרשת האנדופלזמית, DNA אנושי SEC61B (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) מוגבר על ידי PCR מספריית cDNA של תאי HEK293T, ו-H2B DNA (נתרם על ידי D. Lin, מעבדת המפרץ של שנזן) ומשובטים , כנזכר לעיל.אלא אם צוין אחרת, גנים חלבוניים אחרים המשמשים לטרנספקציה ובניית שורות תאים יציבות הוגברו ב-PCR מספריית ה-cDNA של התא HEK293T.G3S (GGGS) ו-G4S (GGGGS) שימשו כמקשרים בין חלבון הפיתיון ל-miniSOG.תג אפיטופ V5 (GKPIPNPLLGLDST) נוסף למבני היתוך אלה.לצורך ביטוי ביונקים וכדי לבסס קו תאים יציב, מבנה ההיתוך של miniSOG שוכפל משנה לתוך הווקטור ה-lentiviral pLX304.לביטוי חיידקי, miniSOG שובט לתוך וקטור pET21a שסומן 6xHis בקצה ה-C.
תאי HEK293T נזרעו ב-2.0 x 105 תאים לבאר בצלחות עם שש בארים והועברו 24 שעות לאחר מכן עם פלסמידים לנטי-ויראליים רקומביננטיים (2.4 מיקרוגרם pLX304) ופלסמידים אריזה ויראליים (1.5 מיקרוגרם psPAX2 ו-1.2 μg psPAX2 ו-1.2μg psPAX2 ו-1.2μg 08 עם LipoBe0yo) , #C0533), כ-80% היתוך.לאחר העברת לילה, המדיום הוחלף והודגרה למשך 24 שעות נוספות.איסוף הנגיף בוצע לאחר 24, 48 ו-72 שעות.לפני הדבקה של שורות תאי המטרה, המדיום הויראלי סונן דרך מסנן 0.8 מיקרומטר (Merck, #millex-GP) ופוליברן (Solarbio, #H8761) נוסף לריכוז של 8 מיקרוגרם/מ"ל.לאחר 24 שעות, התאים הורשו להתאושש על ידי החלפת המדיום.תאים נבחרו באמצעות 5 מיקרוגרם/מ"ל blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) עבור שלושת המעברים הראשונים כבחירה מחמירה נמוכה יותר.לאחר מכן השתמש ב-20 מיקרוגרם/מ"ל כמשטר מחמיר יותר לשלושת הקטעים הבאים.
תאים נזרעו בחדרי 12 בארות (Ibidi, #81201) בצפיפות של כ-20,000 תאים לבאר.כדי לשפר את ההידבקות של תאי HEK293T, הוסף 50 מיקרוגרם/מ"ל פיברונקטין (Corning, #356008) מדולל בתמיסת מלח מאגרת פוספט (PBS, Sangon, #B640435) ב-37 מעלות צלזיוס.החדרים טופלו מראש למשך שעה ולאחר מכן הוסרו עם PBS.לאחר 24 שעות, התאים נשטפו פעם אחת עם PBS, הודגרו עם 1 mM probe 3 בתמיסת מלח מאוזנת טרי של הנקס (HBSS, Gibco, #14025092) למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן הודגרו עם LED כחול (460 ננומטר). ).) הוקרנו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, התאים נשטפו פעמיים עם PBS וקובעו עם 4% פורמלדהיד ב-PBS (Sangon, #E672002) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.עודף פורמלדהיד הוסר מתאי קבוע על ידי שטיפה שלוש פעמים עם PBS.לאחר מכן התאים חולרו עם 0.5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) ב-PBS ונשטפו 3 פעמים עם PBS.לאחר מכן הסר את החדר והוסף לכל דגימה 25 μl של תערובת תגובת קליק המכילה 50 μM Cy3-azid (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4 ) ו-0.5 מ"ג/מ"ל נתרן אסקורבט (אלאדין, מס' S105024) והודגר במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר תגובה מהירה, התאים נשטפו שש פעמים עם PBS המכיל 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) ולאחר מכן נחסמו עם 5% BSA (Abcone, #B24726) ב-PBST למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
לצורך צביעת אימונו-קולקליזציה, תאים הודגרו עם נוגדנים ראשוניים בהתאם לתנאים המצוינים: עכבר anti-V5 tag mAb (1:500, CST, #80076), ארנב anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), נוגדן פוליקלונלי אנטי-קלנקסין ארנב (1:500, Abcam, #ab22595) או נוגדן חד-שבטי אנטי-למין A/C ארנב (1:500; CST, #2032) ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.לאחר שטיפה 3 פעמים עם PBST, התאים הודגרו עם נוגדנים משניים: עז נגד ארנב Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) מדולל 1:1000, עז נגד עכבר Alexa Fluor 594 (CST, #8889) בדילול 1:1000.דילול יש לדלל בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.לאחר מכן התאים נשטפו 3 פעמים עם PBST ונצבעו נגדי עם DAPI (Thermo, #D1306) ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר 3 שטיפות עם PBS, התאים נאטמו ב-50% גליצרול (Sangon, #A600232) ב-PBS לצורך הדמיה.תמונות אימונופלורסנט התקבלו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי ZEISS LSM 900 Airyscan2 ותוכנת ZNE 3.5.
עבור הדמיית פלורסנט חמצן בודד, התאים נשטפו פעמיים עם חיץ HEPES של Hanks לפני הוספת 100 ננומטר Si-DMA במאגר Hanks HEPES (DOJINDO, #MT05).לאחר חשיפה לאור, התאים הודגרו באינקובטור CO2 ב-37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.לאחר מכן התאים נשטפו פעמיים עם חיץ HEPES של הנקס והוצבעו ב-Hoechst במאגר HEPES של הנקס במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר והוצגו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי ZEISS LSM 900., #M36008) במאגר HBSS המכיל סידן ומגנזיום.לאחר חשיפה לאור או לדוקסורוביצין (MCE, #HY-15142A), התאים הודגרו בחממת CO2 ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, נשטפו פעמיים עם חיץ HBSS והודגרו עם Hoechst במאגר HBSS בטמפרטורת החדר.דקות.Doxorubicin שימש כביקורת בדיקה חיובית שבה התאים טופלו ב-20 מיקרומטר דוקסורוביצין ב-HBSS המכיל 1% BSA למשך 30 דקות.תמונות אימונופלורסנט התקבלו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי של Zeiss LSM 900.
תאי HEK293T המבטאים ביציבות mito-miniSOG נזרעו בצפיפות של כ-30% בכלי 15 ס"מ.לאחר 48 שעות, כאשר הושגה מפגש של ~80%, התאים נשטפו פעם אחת עם PBS, הודגרו עם 1 mM Probe 3 במאגר HBSS טרי למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן הוארו עם נורית כחולה למשך 10 דקות בחדר. טֶמפֶּרָטוּרָה..לאחר מכן, התאים נשטפו פעמיים עם PBS, גירדו והושעו מחדש במאגר PBS קר כקרח המכיל מעכבי פרוטאז ללא EDTA (MCE, #HY-K0011).תאים עברו lysed על ידי ביצוע sonicating הקצה במשך דקה 1 (1 שנייה הפעלה ו 1 שנייה כבוי ב 35% משרעת).התערובת שהתקבלה עברה צנטריפוגה ב-15,871 xg למשך 10 דקות ב-4°C כדי להסיר פסולת, וריכוז הסופרנטנט הותאם ל-4 mg/mL באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA (Beyotime, #P0009).שלב 1 מ"ל מהליזאט שלעיל עם 0.1 מ"מ ביוטין אזיד מתכלה (Confluore, #BBBD-14), 1 מ"מ TCEP (Sangon, #A600974), 0.1 מ"מ TBTA ליגנד (אלאדין, #T162437), ו-1 מ"מ CuSO4 חממת CuSO4 תחתונה סיבוב למעלה למשך שעה בטמפרטורת החדר.לאחר תגובה מהירה, הוסף את התערובת לתמיסה המעורבבת מראש (MeOH:CHCl3:H2O = 4 מ"ל:1 מ"ל:3 מ"ל) בבקבוקון זכוכית של 10 מ"ל.הדגימות עורבבו וצנטריפוגה ב-4500 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.התמיסות התחתונות והעליונות נזרקו, המשקע נשטף פעמיים עם 1 מ"ל של מתנול וצנטריפוגה ב-15871×g למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.הוסף 1 מ"ל של 8 M אוריאה (אלדין, מס' U111902) ב-25 מ"מ אמוניום ביקרבונט (ABC, אלאדין, מס' A110539) כדי להמיס את המשקע.הדגימות שוחזרו עם 10 mM dithiothreitol (Sangon, #A100281 ב-25 mM ABC) למשך 40 דקות ב-55°C ולאחר מכן הוספה של 15 mM iodoacetamide טרי (Sangon, #A600539) בטמפרטורת החדר בחושך.אלקילציה תוך 30 דקות..נוספו עוד 5 מ"מ דיתיותרייטול כדי לעצור את התגובה.הכן כ-100 μl חרוזי NeutrAvidin agarose (Thermo, #29202) עבור כל דגימה על ידי שטיפה 3 פעמים עם 1 מ"ל PBS.תמיסת הפרוטאום לעיל דוללה ב-5 מ"ל PBS והודגרה עם חרוזי Neutravidin agarose שטופים מראש למשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, החרוזים נשטפו 3 פעמים עם 5 מ"ל PBS המכילים 0.2% SDS (Sangon, #A600485), 3 פעמים עם 5 מ"ל PBS המכילים 1M אוריאה, ו-3 פעמים עם 5 מ"ל ddH2O.לאחר מכן, החרוזים נקצרו על ידי צנטריפוגה והוצעו מחדש ב-200 μl של 25 mM ABC המכילים 1 M אוריאה, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) ו-20 ng/μl טריפסין (Promega, #V5280).Trypsinize לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם סיבוב.התגובה הופסקה על ידי הוספת חומצה פורמית (Thermo, # A117-50) עד שה-pH הגיע ל-2-3.החרוזים נשטפו 3 פעמים עם 1 מ"ל של PBS המכיל 0.2% SDS, 3 פעמים עם 1 מ"ל של PBS המכיל 1 M אוריאה, ולאחר מכן 3 פעמים עם 1 מ"ל מים מזוקקים.הפפטידים המותאמים שוחררו על ידי תמוגה קלה (365 ננומטר) למשך 90 דקות באמצעות 200 μl של 70% MeOH.לאחר צנטריפוגה, הסופרנטנט נאסף.לאחר מכן, החרוזים נשטפו פעם אחת עם 100 μl של 70% MeOH והסופרנטנטים אוחדו.דגימות יובשו בריכוז ואקום Speedvac ואוחסנו ב-20 מעלות צלזיוס עד לניתוח.
כדי לזהות ולכמת פפטידים שעברו שינוי בחמצן בודד, דגימות הומסו מחדש ב-0.1% חומצה פורמית ו-1 מיקרוגרם של פפטידים נותחו באמצעות ספקטרומטר מסה Orbitrap Fusion Lumos Tribrid מצויד במקור ננו ESI מ-Tune ו-Xcalibur מתוכנת הספק 4.3.דגימות הופרדו על גבי עמודה נימית ארוזה פנימית בגודל 75 מיקרומטר × 15 ס"מ עם חומר של 3 מיקרומטר C18 (ReproSil-pur, #r13.b9.) וחוברו למערכת EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo).הפפטידים הופרדו בכרומטוגרפיה ליניארית של גרדיאנט של 95 דקות מ-8% ממס B ל-50% ממס B (A = 0.1% חומצה פורמית במים, B = 0.1% חומצה פורמית ב-80% אצטוניטריל), ולאחר מכן עלו באופן ליניארי ל-98% B min. תוך 6 דקות בקצב זרימה של 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos אוספת נתונים לסירוגין בין סריקת MS מלאה לסריקה MS2 בהתאם לנתונים.מתח הקפיצה נקבע ל-2.1 קילוואט והטמפרטורה של נימי הובלת היונים הייתה 320 מעלות צלזיוס.ספקטרום MS (350-2000 m/z) נאספו ברזולוציה של 120,000, AGC 4 × 105 וזמן קלט מרבי של 150 אלפיות השנייה.10 המבשרים הטעונים כפולים הנפוצים ביותר בכל סריקה מלאה פוצלו באמצעות HCD עם אנרגיית התנגשות מנורמלת של 30%, חלון בידוד מרובע של 1.6 מ'/ז' והגדרת רזולוציה של 30,000.יעד AGC עבור ספקטרומטריית מסה טנדם באמצעות 5×104 וזמן קלט מקסימלי 150 אלפיות השנייה.החריג הדינמי מוגדר ל-30 שניות. יונים שלא הוקצו או כאלה עם מטען של 1+ ו->7+ נדחו עבור MS/MS. יונים שלא הוקצו או כאלה עם מטען של 1+ ו->7+ נדחו עבור MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. יונים שלא הוקצו או יונים עם מטען של 1+ ו->7+ נדחו עבור MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. יונים לא מוגדרים או יונים עם מטענים של 1+ ו->7+ נדחו עבור MS/MS.
הנתונים הגולמיים מעובדים באמצעות פלטפורמת המחשוב FragPipe המבוססת על MSFragger.הטיות מסה וחומצות אמינו מתאימות נקבעו באמצעות אלגוריתם חיפוש פתוח עם סובלנות מסה מקדימה של -150 עד 500 דא.לאחר מכן זוהו פפטידים שעברו שינוי באמצעות שינויים בהיסטידין עם עליות מסה של +229.0964 ו-+247.1069 Da ב-PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
תאים המבטאים באופן יציב את הגן ה-miniSOG המאוחד צופו בצלחות של 6 ס"מ.כשהגיעו לכ-80% מפגש, התאים נשטפו פעם אחת עם HBSS (Gibco, #14025092), ואז הודגרו עם בדיקות כימיות ב-HBSS למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס והוארו באור כחול.LED 10W למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.כדי לקבוע איזה סוג של מיני חמצן תגובתי מעורב ב-PDPL, 0.5 מ"מ ויטמין C (MCE, #HY-B0166), 5 מ"מ Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), 100 מ"מ מניטול (Energy Chemical, #69-65-8), 100 מיקרומטר H2O2, 10 מ"מ NaN3 נוספו לתאים כתוספים.לאחר שטיפה ב-PBS קר, התאים נגרדו, נאספו בשפופרות צנטריפוגות של 1.5 מ"ל ועברו צלילים עם קצה למשך דקה אחת ב-200 μl של PBS עם מעכב פרוטאז 1x ללא EDTA (1 שניות ו-1 שניות ללא, משרעת 35%).התערובת שהתקבלה עברה צנטריפוגה ב-15,871 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס וריכוז הסופרנטנט הותאם ל-1 מ"ג/מ"ל באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA.כ-50 μl מהליזאט לעיל הודגרה עם 0.1 מ"מ רודמין אזיד (אלדין, מס' T131368), 1 מ"מ TCEP, 0.1 מ"מ TBTA ליגנד ו-1 מ"מ CuSO4 למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם סיבוב מלמטה למעלה.לאחר תגובת הלחיצה, המשקעים עם אצטון בוצעו על ידי הוספת 250 μl של אצטון מצונן מראש לדגימות, דגירה ב-20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות וצנטריפוגה ב-6010×g למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.אספו את הכדור והרתיחו ב-50 μl של חיץ 1x Laemmli למשך 10 דקות ב-95 מעלות צלזיוס.לאחר מכן נותחו דגימות על ג'לים ארוכים SDS-PAGE והוצגו באמצעות מערכת ההדמיה Bio-rad ChemiDoc MP Touch עם תוכנת Image Lab Touch.
ביטוי וטיהור של החלבון הרקומביננטי miniSOG-6xHis בוצע כמתואר קודם לכן.בקצרה, תאי E. coli BL21(DE3) (TransGen, #CD701-02) עברו טרנספורמציה עם pET21a-miniSOG-6xHis וביטוי חלבון הושרה עם 0.5 mM IPTG (Sangon, #A600168).לאחר תמוגה של תאים, חלבונים טוהרו באמצעות חרוזי אגרוז Ni-NTA (MCE, מס' 70666), עברו דיאליזה נגד PBS, ואוחסנו ב-80 מעלות צלזיוס.
עבור בדיקת קרבת תווית חוץ גופית מבוססת נוגדנים, ערבבו 100 מיקרומטר מיניSOG מטוהר, 1 מ"מ בדיקה 3 ו-1 מיקרוגרם נוגדן חד שבטי עכבר אנטי-תווית (TransGen, #HT501-01) ב-PBS לנפח תגובה כולל של 50 μl..תערובת התגובה הוקרנה באור LED כחול למשך 0, 2, 5, 10 ו-20 דקות בטמפרטורת החדר.התערובת הודגרה עם 0.1 מ"מ ביוטין-PEG3-אזיד (Aladdin, #B122225), 1 מ"מ TCEP, 0.1 מ"מ TBTA ליגנד ו-1 מ"מ CuSO4 למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר על מנער תנועה כלפי מעלה.לאחר תגובה מהירה, הוסף 4x חיץ של Laemmli ישירות לתערובת והרתיח ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.דגימות נותחו על ג'לים SDS-PAGE ונותחו על ידי סופג מערבי עם streptavidin-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
פפטיד סינטטי המכיל היסטידין עם אמידה C-טרמינלית (LHDALDAK-CONH2) שימש לניתוח תיוג חוץ-גופני מבוסס פפטיד סמוך.במבחן זה, 100 מיקרומטר מיניSOG מטוהר, 10 מ"מ בדיקה 3 ו-2 מיקרוגרם/מ"ל פפטיד סינטטי ב-PBS בנפח תגובה כולל של 50 מיקרוגל.תערובת התגובה הוקרנה באור LED כחול למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.מיקרוליטר אחד של דגימה נותח באמצעות מערכת LC-MS (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight ספקטרומטר מסה עם תוכנת ניתוח ספקטרום MassLynx).
תאי HEK293T המבטאים באופן יציב את גן היתוך miniSOG נזרעו בצלחות של 10 ס"מ עבור קווים עם לוקליזציה שונה של אברונים (Mito, ER, Nucleus) וצלחות של 15 ס"מ לקווי Parkin-miniSOG ו-BRD4-miniSOG.כשהגיעו ל-90% התכנסות, התאים נשטפו פעם אחת עם HBSS, ולאחר מכן הודגרו עם בדיקה 3 ב-HBSS למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס והוארו ב-LED כחול של 10 W בטמפרטורת החדר.עבור תיוג ללא מגע של פרקין, נוספו 10 מיקרומטר פרוטון קרבוניל ציאניד נושא m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) עם בדיקה 3 ב-HBSS למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.שלבי תמוגת התא, הכימיה של הלחיצה, ההפחתה והאלקילציה היו זהים לתואר לעיל, פרט לכך שנוספו 2 מ"ג של ליזאט וביוטין אזיד PEG3 נעשה שימוש בתגובת הקליק במקום ביוטין אזיד מתכלה.לאחר העשרה, החרוזים נשטפו 3 פעמים עם 5 מ"ל של PBS המכילים 0.2% SDS, 3 פעמים עם 5 מ"ל של PBS המכילים 1 M אוריאה, ו-3 פעמים עם 5 מ"ל של PBS.לאחר מכן, 2 מיקרוגרם טריפסין נוספו ל-300 μl 25 mM ABC המכילים 1 M אוריאה כדי לפצח את החלבון למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס.התגובה הופסקה על ידי הוספת חומצה פורמית עד שהושג pH של 2-3.לאחר טריפסיניזציה על חרוזים, תמיסת הפפטיד הוסרה באמצעות עמודת SOLAµ HRP (Thermo, #60209-001) וייבשה ברכז ואקום Speedvac.פפטידים הומסו מחדש ב-0.1% חומצה פורמית ו-500 ננוגרם של פפטידים נותחו באמצעות ספקטרומטר מסה Orbitrap Fusion Lumos Tribrid המצויד במקור הננו-ESI שתואר לעיל.הפפטידים הופרדו על עמודות קדם מסחריות של RP-HPLC (75 מיקרומטר על 2 ס"מ) (תרמו, מס' 164946) ועל עמודות RP-HPLC אנליטיות (75 מיקרומטר על 25 ס"מ) (תרמו, מס' 164941), שניהם מלאו ב-2 מיקרומטר.שיפוע מ-8% ל-35% ACN תוך 60 דקות, ולאחר מכן גדל באופן ליניארי ל-98% B תוך 6 דקות בקצב זרימה של 300 Nl/min.ספקטרום MS (350-1500 m/z) נאספו ברזולוציה של 60,000, AGC 4 × 105 וזמן קלט מרבי של 50 אלפיות השנייה.היונים שנבחרו פוצלו ברצף על ידי HCD במחזורים של 3 שניות עם אנרגיית התנגשות מנורמלת של 30%, חלון בידוד מרובע קוטבי של 1.6 מ"ז ורזולוציה של 15000. מטרת AGC טנדם ספקטרומטר מסה 5 × 104 וזמן הזרקה מקסימלי נעשה שימוש של 22 אלפיות השנייה.ההכללה הדינמית מוגדרת ל-45 שניות. יונים שלא הוקצו או כאלה עם מטען של 1+ ו->7+ נדחו עבור MS/MS. יונים שלא הוקצו או כאלה עם מטען של 1+ ו->7+ נדחו עבור MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. יונים שלא הוקצו או יונים עם מטען של 1+ ו->7+ נדחו עבור MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. יונים לא מוגדרים או יונים עם מטענים של 1+ ו->7+ נדחו עבור MS/MS.
שלבי הכנת הדגימה עד להעשרה של חרוזי NeutrAvidin היו זהים לניתוח LC-MS/MS שתואר לעיל.כ-50 מיקרוגרם של lysate שימשו כקלט לבקרת טעינה ו-2 מ"ג של lysate שימשו לתגובות קליקים.לאחר העשרה ושטיפה עם neutravidin, החלבונים הקשורים נפלטו על ידי הוספת 50 μl של חיץ Laemmli של חרוזי שרף agarose והרתחה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.קלט עומס בקרה ודגימות מועשרות בחרוזים נותחו על ידי SDS-PAGE והועברו לממברנות PVDF (Millipore, #ISEQ00010) על ידי שיטות Western blot סטנדרטיות.הממברנות נחסמו עם 5% חלב רזה (Sangon, #A600669) ב-TBS המכיל 0.1% tween-20 (TBST) והודגרו ברצף עם נוגדנים ראשוניים ומשניים.נוגדנים ראשוניים הודללו 1:1000 בחלב רזה של 5% ב-TBST והודגרו למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.נוגדנים משניים שימשו ביחס של 1:5000 והודגרו למשך שעה בטמפרטורת החדר.הממברנות הוצגו על ידי כימילומינסנציה באמצעות מערכת ההדמיה Chemidoc MP.כל הסריקות הלא חתוכות של כתמים וג'לים באיור מוצגות כנתונים גולמיים.
נוגדנים ראשוניים ששימשו במחקר זה כללו נוגדן חד שבטי נגד SFPQ של ארנב (CST, מס' 71992), נוגדן חד שבטי לארנב נגד FUS (CST, מס' 67840), נוגדן רב שבטי לארנב נגד NSUN2 (Proteintech, מס' 20854-1 AP), נוגדן רב שבטי אנטי-mSin3A לארנב (Abcam, #ab3479), נוגדן חד שבטי נגד תג עכבר (TransGen, #HT201-02), נוגדן חד שבטי אנטי-β-אקטין עכבר (TransGen, #HC201-01), נוגדן לארנב -נוגדן חד שבטי CDK2 (ABclonal, #A0094), נוגדן חד שבטי ארנב ל-CTBP1 (ABclonal, #A11600), נוגדן רב שבטי ארנב ל-DUT (ABclonal, #A2901), נוגדן רב שבטי לארנב ל-PS54, #ABclonal-MC, #ABclonr נוגדן רב שבטי DNAJB1 (ABclonal, # A5504).נוגדנים אלו שימשו בדילול 1:1000 בחלב דל שומן של 5% ב-TBST.הנוגדנים המשניים בשימוש במחקר זה כללו IgG אנטי ארנב (TransGen, #HS101-01), IgG אנטי עכבר (TransGen, #HS201-01) בדילול 1:5000.
כדי להמשיך ולחקור אם BRD4 יוצר אינטראקציה עם SFPQ, צלחו תאי HEK293T ו-BRD4-miniSOG יציבים המבטאים HEK293T בצלחות של 10 ס"מ.התאים נשטפו עם PBS קר והוסרו ב-1 מ"ל חיץ תמוגה של Pierce IP (Thermo Fisher, #87787) עם מעכב פרוטאז ללא EDTA למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, הליזטים נאספו בשפופרות צנטריפוגות של 1.5 מ"ל ועברו צנטריפוגה ב-15,871 xg למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.הסופרנטנט נקצר והודגרה עם 5 מיקרוגרם של נוגדן חד שבטי עכבר המסומן נגד V5 (CST, #80076) למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.שטפו כ-50 μl של חלבון A/G חרוזים מגנטיים (MCE, #HY-K0202) פעמיים עם PBS המכיל 0.5% Tween-20.לאחר מכן הודגרו את lysates התא עם חרוזים מגנטיים במשך 4 שעות ב-4 מעלות צלזיוס עם סיבוב מלמטה למעלה.לאחר מכן החרוזים נשטפו ארבע פעמים עם 1 מ"ל של חיץ PBST והורתחו ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.דגימות נותחו על ג'לים SDS-PAGE והועברו לממברנות PVDF בשיטות Western blot סטנדרטיות.הממברנות נחסמו בחלב רזה של 5% ב-TBST והודגרו ברצף עם נוגדנים ראשוניים ומשניים.נוגדן ראשוני של ארנב אנטי-SFPQ חד שבטי (CST, #71992) שימש ביחס של 1:1000 בחלב רזה של 5% ב-TBST והודגרה למשך הלילה ב-4°C.נעשה שימוש ב-IgG נגד ארנב ביחס של 1:5000 והודגרה למשך שעה בטמפרטורת החדר.הממברנות הוצגו על ידי כימילומינסנציה באמצעות מערכת ההדמיה Chemidoc MP.
כל המבנים ששימשו לניתוח שטחי השטח הנגישים לממס (SASA) התקבלו מ-Protein Data Bank (PDB)52 או מ-AlphaFold Protein Structure Database53.SASA מוחלט חושב עבור כל שארית באמצעות תוכנית FreeSASA.רק נתוני SASA מלאים וחד משמעיים עבור היסטידין המסומן ושכניו שימשו להשגת ה-SASA הממוצע עבור כל מבנה.הנגישות היחסית לממס (RSA) עבור כל היסטידין חושבה על ידי חלוקת ערך ה-SASA המוחלט בשטח הפנים המרבי האמפירי האפשרי של השאריות הזמינות לממס.כל ההיסטידינים סווגו אז כמוסתרים אם ה-RSA הממוצע היה מתחת ל-20%, אחרת נחשפו56.
קבצים גולמיים שהושגו במצב DDA נבדקו באמצעות Proteome Discoverer (v2.5) או MSfragger (Fragpipe v15.0) במסד הנתונים המתאים של SwissProt חלבונים המאומתים המכיל מזהמים נפוצים.הפפטידים דרשו טריפסין מלא עם שני אתרי ביקוע חסרים, מתילציה של קרבמויל כשינוי קבוע וחמצון מתיונין כשינוי דינמי.סובלנות משקל מבשר ומקטע נקבעו ל-10 ppm ו-0.02 Da (MS2 Orbitrap), בהתאמה. פגיעות מזהמים הוסרו, וחלבונים סוננו כדי להשיג שיעור גילוי שגוי של <1%. פגיעות מזהמים הוסרו, וחלבונים סוננו כדי להשיג שיעור גילוי שגוי של <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэфициент коэфициент 1%. פגיעות מזהמים הוסרו וחלבונים סוננו כדי לתת שיעור זיהוי שווא של <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложных <1%. פגיעות מזהמים הוסרו וחלבונים סוננו כדי להשיג שיעור חיובי שגוי של <1%.לניתוח כמותי ללא שימוש בתוויות, נעשה שימוש בתכולת חלבון מנורמלת משלוש חזרות ביולוגיות.ניתוח לוקליזציה תת-תאי של חלבון בוצע באמצעות ניתוח Gene Ontology (GO) מ-DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 ומסדי נתונים שנאספו ופורסמו על ידי קבוצת Alice Ting.מפת הר הגעש התקבלה מפרסאוס (v1.6.15.0). שינויים בקפלים בשפע החלבון נבדקו עבור מובהקות סטטיסטית באמצעות מבחן t דו-צדדי, ופגעי חלבון זוהו עם שינוי בשפע >2 (אלא אם צוין אחרת) וערך p <0.05. שינויים בקפלים בשפע החלבון נבדקו עבור מובהקות סטטיסטית באמצעות מבחן t דו-צדדי, ופגעי חלבון זוהו עם שינוי בשפע >2 (אלא אם צוין אחרת) וערך p <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. שינויים בקפלים בתכולת החלבון נבדקו עבור מובהקות סטטיסטית באמצעות מבחן t דו-זנב, והתאמות חלבון זוהו עם שינוי בתוכן >2 (אלא אם צוין אחרת) וערך ap <0.05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 变化 的 统计 显着性 ， 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （除非 另 有 说明） p 值 <0.05。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （另 说明 说明） 和 p 值 <0.05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. מובהקות סטטיסטית של שינויים קיפולים בתכולת החלבון נבדקה באמצעות מבחן t דו-זנב, והתאמות חלבון נקבעו עבור שינויים בתכולה >2 (אלא אם צוין אחרת) וערכי p <0.05.ניתוח אינטראקציה של חלבון בוצע באמצעות ניתוח GO יחד עם מסד הנתונים של String.
שלושה שכפולים ביולוגיים בוצעו עם תוצאות דומות.ניתוח סטטיסטי נעשה עם GraphPad Prism (תוכנת GraphPad) וחלקות הר געש נוצרו עם Perseus (v1.6.15.0).כדי להשוות בין שתי הקבוצות, ערכי p נקבעו באמצעות מבחן t של סטודנט דו-זנבתי.רק חלבוני יחיד שזוהו לפחות פעמיים בקבוצת הניסוי נכללו בחלקות הר הגעש, והערכים החסרים התואמים בקבוצת הביקורת הוחלפו בפרסאוס מהתפלגות נורמלית כדי שניתן יהיה לחשב את ערך ה-p.פסי שגיאה מייצגים את הממוצע ± סטיית התקן.בניתוחים פרוטאומיים לניתוח סטטיסטי, שפע החלבונים שהופיעו לפחות בשני שכפולים ביולוגיים נשמר.לא נעשה שימוש בשיטות סטטיסטיות כדי לקבוע מראש את גודל המדגם.הניסויים אינם אקראיים.החוקרים לא היו עיוורים למשימות במהלך הניסוי והערכת התוצאות.
למידע נוסף על עיצוב מחקר, עיין בתקציר דוח מחקר הטבע המקושר למאמר זה.
נתוני ספקטרומטריית המסה שהתקבלו במחקר זה הוגשו ל-ProteomeXchange Consortium דרך מאגר השותפים iProX57 תחת מזהה מערך הנתונים PXD034811 (מסד נתונים PDPL-MS).נתונים גולמיים מסופקים בצורה של קבצי נתונים גולמיים.מאמר זה מספק את הנתונים המקוריים.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. היכרות עם השכונה: שימוש בביוטינילציה תלוית קרבה לאפיון מתחמי חלבון ומיפוי אברונים. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. היכרות עם השכונה: שימוש בביוטינילציה תלוית קרבה לאפיון מתחמי חלבון ומיפוי אברונים.Gingras, AS, Abe, KT ו- Raut, B. היכרות עם הסביבה: שימוש בביוטינילציה תלוית קרבה כדי לאפיין קומפלקסים של חלבונים ולמפות אברונים. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. הבנת השכונה: השתמשו בתלות השכונה בחיים ביולוגיים.Gingras, AS, Abe, KT and Raut, B. הבנת הקרבה: אפיון מתחמי חלבון ומיפוי אברונים באמצעות ביוטינילציה תלוית קרבה.נוֹכְחִי.דעתי.כִּימִי.ביולוגיה 48, 44–54 (2019).
גרי, JB et al.מיפוי המיקרו-סביבה על ידי העברת אנרגיית דקסטר לתאי מערכת החיסון.מדע 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.רשתות בקנה מידה של שני פרוטאומים מזהות עיצוב מחדש ספציפי לתא של האינטראקטום האנושי.Cells 184, 3022–3040.e3028 (2021).
זמן פרסום: 15 בספטמבר 2022
