חֲדָשׁוֹת

תודה שביקרת ב-Nature.com.לגרסת הדפדפן שבה אתה משתמש יש תמיכת CSS מוגבלת.לקבלת החוויה הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או להשבית את מצב תאימות ב-Internet Explorer).בינתיים, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, נעבד את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
חומרים רגישים לפוטו יעילים חשובים במיוחד לשימוש הקליני הנרחב בפוטותרפיה.עם זאת, חומרי רגישות פוטו קונבנציונליים סובלים בדרך כלל מספיגה באורך גל קצר, יציבות תמונות לא מספקת, תפוקה קוונטית נמוכה של מיני חמצן תגובתיים (ROS), ומרווה הנגרמת על ידי צבירה של ROS.כאן אנו מדווחים על רגישות פוטוסנסיבית על-מולקולרית (NIR) כמעט אינפרא אדום (RuDA) המתווך על ידי הרכבה עצמית של קומפלקסים אורגנו-מתכתיים של Ru(II)-ארן בתמיסה מימית.RuDA יכול ליצור חמצן יחיד (1O2) רק במצב צבור, והוא מציג התנהגות ברורה של יצירת 1O2 הנגרמת על ידי צבירה עקב עלייה משמעותית בתהליך ההצלבה בין מערכת הסינגלט-טריפלט.תחת פעולת אור לייזר 808 ננומטר, RuDA מציג תפוקה קוונטית של 1O2 של 16.4% (ירוק אינדוסיאנין מאושר על ידי ה-FDA: ΦΔ=0.2%) ויעילות המרה פוטו-תרמית גבוהה של 24.2% (ננורודים מזהב מסחריים) עם יציבות צילום מעולה.: 21.0%, ננו-קונכיות זהב: 13.0%.בנוסף, RuDA-NPs עם תאימות ביולוגית טובה יכולים להצטבר באופן מועדף באתרי הגידול, ולגרום לנסיגה משמעותית של הגידול במהלך טיפול פוטודינמי עם ירידה של 95.2% בנפח הגידול in vivo.טיפול פוטודינמי משפר צבירה זה מספק אסטרטגיה לפיתוח רגישות פוטו עם תכונות פוטופיזיקליות ופוטוכימיות חיוביות.
בהשוואה לטיפול קונבנציונלי, טיפול פוטודינמי (PDT) הוא טיפול אטרקטיבי לסרטן בשל יתרונותיו המשמעותיים כגון שליטה מרחבית-זמנית מדויקת, אי-פולשניות, עמידות לתרופות זניחה ומזעור תופעות הלוואי 1,2,3.תחת הקרנת אור, ניתן להפעיל את חומרי הפוטוסנסיטיזציה המשמשים ליצירת מיני חמצן תגובתיים במיוחד (ROS), מה שמוביל לאפופטוזיס/נמק או תגובות חיסוניות4,5. עם זאת, לרוב חומרי הצילום הרגילים, כגון כלורינים, פורפירינים ואנתרקינונים, יש קליטה באורך גל קצר יחסית (תדירות < 680 ננומטר), ובכך מביאה לחדירת אור לקויה בגלל הספיגה האינטנסיבית של מולקולות ביולוגיות (למשל, המוגלובין ומלנין) ב האזור הגלוי6,7. עם זאת, לרוב חומרי הצילום הרגילים, כגון כלורינים, פורפירינים ואנתרקינונים, יש קליטה באורך גל קצר יחסית (תדירות < 680 ננומטר), ובכך מביאה לחדירת אור לקויה בגלל הספיגה האינטנסיבית של מולקולות ביולוגיות (למשל, המוגלובין ומלנין) ב האזור הגלוי6,7. Однако большинство обычных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, обладают относительно коротковолновым поглощением (частота < 680 нм), что приводит к плохому проникновению света из-за интенсивного поглощения биологических молекул (например, гемоглобина и меланина) в видимая область6,7. עם זאת, לרוב לחומרי הרגישות הנפוצים כגון כלורינים, פורפירינים ואנתרקינונים יש קליטה באורך גל קצר יחסית (<680 ננומטר) וכתוצאה מכך לחדירת אור לקויה עקב ספיגה אינטנסיבית של מולקולות ביולוגיות (למשל המוגלובין ומלנין) לאזור הנראה6,7.V导致光穿透性差.A吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 HI导致光穿透性差. Однако большинство традиционных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, имеют относительно коротковолновое поглощение (частота < 680 нм) из-за сильного поглощения биомолекул, таких как гемоглобин и меланин, что приводит к плохому проникновению света. עם זאת, לרוב חומרי הרגישות המסורתיים כגון כלורינים, פורפירינים ואנתרקינונים יש קליטה באורך גל קצר יחסית (תדירות < 680 ננומטר) עקב ספיגה חזקה של ביומולקולות כגון המוגלובין ומלנין וכתוצאה מכך חדירת אור לקויה.אזור גלוי 6.7.לכן, חומרי רגישות סופגים לאינפרא אדום (NIR) המופעלים ב"חלון הטיפולי" של 700-900 ננומטר מתאימים היטב לפוטותרפיה.מכיוון שאור אינפרא אדום קרוב נספג הכי פחות ברקמות ביולוגיות, הוא יכול להוביל לחדירה עמוקה יותר ולפחות נזקי צילום8,9.
למרבה הצער, לחומרי פוטוסנסיטיזציה קיימים שסופגים NIR יש בדרך כלל יציבות פוטו גרועה, יכולת יצירת חמצן בודדת נמוכה (1O2), וריבוי 1O2 המושרה על ידי צבירה, מה שמגביל את היישום הקליני שלהם10,11.למרות שנעשו מאמצים גדולים לשפר את המאפיינים הפוטופיזיים והפוטוכימיים של חומרי רגישות פוטו קונבנציונליים, עד כה מספר דיווחים דיווחו כי חומרי פוטוסנסיטציה סופגי NIR יכולים לפתור את כל הבעיות הללו.בנוסף, מספר רגישות פוטו הראו הבטחה ליצירה יעילה של 1O212,13,14 כאשר הם מוקרנים באור מעל 800 ננומטר, מכיוון שאנרגיית הפוטונים יורדת במהירות באזור ה-IR הקרוב.טריפנילאמין (TFA) כתורם אלקטרונים ו-[1,2,5]תיאדיאזול-[3,4-i]dipyrido[a,c]phenazine (TDP) כקבוצת קולטני אלקטרונים סוג תורם-מקבל (DA) צובע מחלקה של צבעים, סופגים כמעט אינפרא אדום, שנחקרו בהרחבה עבור דימות ביולוגיות קרובות לאינפרא אדום וטיפול פוטותרמי (PTT) בשל הפער הצר שלהם.לפיכך, ניתן להשתמש בצבעים מסוג DA עבור PDT עם עירור קרוב ל-IR, אם כי לעתים רחוקות הם נחקרו כגורמים לפוטוסנסיטיזציה עבור PDT.
ידוע היטב כי היעילות הגבוהה של מעבר בין-מערכתי (ISC) של גורמים פוטו-סנסיטיזרים מקדמת את היווצרות 1O2.אסטרטגיה נפוצה לקידום תהליך ה-ISC היא לשפר את צימוד הספין-מסלול (SOC) של חומרי רגישות פוטו על ידי החדרת אטומים כבדים או חלקים אורגניים מיוחדים.עם זאת, לגישה זו יש עדיין כמה חסרונות ומגבלות19,20.לאחרונה, הרכבה עצמית על-מולקולרית סיפקה גישה אינטליגנטית מלמטה למעלה לייצור חומרים פונקציונליים ברמה המולקולרית,21,22 עם יתרונות רבים בפוטותרפיה: (1) לפוטוסנסיטיזרים בהרכבה עצמית עשוי להיות פוטנציאל ליצור מבני סרט.בדומה למבנים אלקטרוניים עם חלוקה צפופה יותר של רמות אנרגיה עקב מסלולים חופפים בין אבני בניין.לכן, התאמת האנרגיה בין המצב הנרגש של הסינגל התחתון (S1) לבין המצב המעורב של הטריפלט השכן (Tn) תשתפר, מה שמועיל לתהליך ISC 23, 24.(2) הרכבה על-מולקולרית תפחית הרפיה לא-קרינה על בסיס מנגנון הגבלת התנועה התוך-מולקולרית (RIM), אשר גם מקדם את תהליך ISC 25, 26.(3) המכלול העל-מולקולרי יכול להגן על המולקולות הפנימיות של המונומר מפני חמצון ופירוק, ובכך לשפר מאוד את היציבות הפוטו-סנסיטיזית.בהתחשב ביתרונות שלעיל, אנו מאמינים שמערכות פוטוסנסיטיזר על-מולקולריות יכולות להיות חלופה מבטיחה להתגבר על החסרונות של PDT.
קומפלקסים מבוססי Ru(II) הם פלטפורמה רפואית מבטיחה ליישומים פוטנציאליים באבחון וטיפול במחלות בשל תכונותיהם הביולוגיות הייחודיות והאטרקטיביות28,29,30,31,32,33,34.בנוסף, שפע המצבים הנרגשים והתכונות הפוטו-פיזיקו-כימיות הניתנות לכוונון של קומפלקסים מבוססי Ru(II) מספקים יתרונות גדולים לפיתוח גורמים פוטו-רגישים מבוססי Ru(II)35,36,37,38,39,40.דוגמה בולטת היא הקומפלקס Ruthenium(II) polypyridyl TLD-1433, שנמצא כעת בניסויים קליניים שלב II כגורם פוטו-סנסיטיזר לטיפול בסרטן שלפוחית ​​השתן הלא-שריר (NMIBC)41.בנוסף, קומפלקסים אורגנו-מתכתיים של רותניום(II)ארן נמצאים בשימוש נרחב כחומרים כימותרפיים לטיפול בסרטן בשל הרעילות הנמוכה שלהם וקלות השינוי42,43,44,45.התכונות היוניות של קומפלקסים אורגנו-מתכתיים של Ru(II)-aren יכולות לא רק לשפר את המסיסות הירודה של כרומופורי DA בממסים נפוצים, אלא גם לשפר את הרכבה של כרומופורי DA.בנוסף, המבנה החצי-סנדוויץ' הפסאודו-אוקטהדרלי של הקומפלקסים האורגנומי-מטאליים של Ru(II)-arenes יכול למנוע באופן סטרילי H-aggregation של כרומופורים מסוג DA, ובכך להקל על היווצרות של J-aggregation עם פסי ספיגה שהוסטו לאדום.עם זאת, חסרונות מובנים של קומפלקסים Ru(II)-aren, כגון יציבות נמוכה ו/או זמינות ביולוגית ירודה, יכולים להשפיע על היעילות הטיפולית ופעילות in vivo של קומפלקסים של ארן-Ru(II).עם זאת, מחקרים הראו שניתן להתגבר על החסרונות הללו על ידי עטיפה של קומפלקסים של רותניום עם פולימרים ביו-תואמים על ידי אנקפסולציה פיזית או צימוד קוולנטי.
בעבודה זו אנו מדווחים על קומפלקסים מצומדים ל-DA של Ru(II)-arene (RuDA) עם טריגר NIR באמצעות קשר תיאום בין הכרומופור DAD וחלק Ru(II)-arene.הקומפלקסים המתקבלים יכולים להרכיב את עצמם לתוך שלפוחיות מתכת-סופרמולקולריות במים עקב אינטראקציות לא קוולנטיות.יש לציין שההרכבה העל-מולקולרית העניקה ל-RuDA תכונות הצלבה בין-מערכתיות הנגרמות על ידי פילמור, אשר הגדילו באופן משמעותי את יעילות ה-ISC, שהייתה חיובית מאוד עבור PDT (איור 1A).כדי להגביר את הצטברות הגידול ואת התאימות הביולוגית in vivo, נעשה שימוש ב-Pluronic F127 (PEO-PPO-PEO) שאושר על ידי ה-FDA כדי לעטוף את RuDA47,48,49 ליצירת ננו-חלקיקים RuDA-NP (איור 1B) שפעלו כ-PDT/Dual- יעיל ביותר. מצב PTT proxy.בפוטותרפיה בסרטן (איור 1C), RuDA-NP שימש לטיפול בעכברים עירומים עם גידולי MDA-MB-231 כדי לחקור את היעילות של PDT ו-PTT in vivo.
המחשה סכמטית של המנגנון הפוטופיזי של RuDA בצורות מונומריות ומצטברות לפוטותרפיה בסרטן, סינתזה של B RuDA-NPs ו-C RuDA-NPs עבור PDT ו-PTT המופעלים על ידי NIR.
RuDA, המורכב מפונקציונליות TPA ו- TDP, הוכן לפי הנוהל המוצג באיור משלים 1 (איור 2A), ו-RuDA אופיינה על ידי ספקטרום 1H ו- 13C NMR, ספקטרומטריית מסה יינון אלקטרוספריי וניתוח אלמנטים (איורים משלימים 2-4 ).מפת הבדלי צפיפות האלקטרונים של RuDA של המעבר הנמוך ביותר ביחידות חושבה על ידי תיאוריית פונקציונליות צפיפות תלוית זמן (TD-DFT) כדי לחקור את תהליך העברת המטען.כפי שמוצג באיור משלים 5, צפיפות האלקטרונים נסחפת בעיקר מטריפנילמין ליחידת המקבל TDP לאחר עירור פוטו, אשר ניתן לייחס למעבר העברת מטען תוך-מולקולרי (CT) טיפוסי.
מבנה כימי של עפרה B ספקטרום ספיגה של עפרה בתערובות של יחסים שונים של DMF ומים.C ערכי ספיגה מנורמלים של RuDA (800 ננומטר) ו-ICG (779 ננומטר) לעומת זמן ב-0.5 W cm-2 של אור לייזר 808 ננומטר.D הפירוק הפוטו-דיגרציוני של ABDA מסומן על ידי היווצרות הנגרמת על ידי RuDA של 1O2 בתערובות DMF/H2O עם תכולת מים שונה תחת פעולת קרינת לייזר באורך גל של 808 ננומטר והספק של 0.5 W/cm2.
תקציר - ספקטרוסקופיה ספיגה גלויה ל-UV שימשה כדי לחקור את תכונות ההרכבה העצמית של עפרה בתערובות של DMF ומים ביחסים שונים.כפי שמוצג באיור.2B, RuDA מציג פסי ספיגה מ-600 עד 900 ננומטר ב-DMF עם פס ספיגה מקסימלי ב-729 ננומטר.הגדלת כמות המים הובילה להזזה אדומה הדרגתית של ספיגת העפר המקסימלית ל-800 ננומטר, מה שמעיד על צבירה J של עפרה במערכת המורכבת.ספקטרום הפוטו-luminescence של RuDA בממסים שונים מוצגים באיור משלים 6. נראה כי RuDA מציג זוהר NIR-II טיפוסית עם אורך גל פליטה מרבי של כ.1050 ננומטר ב-CH2Cl2 ו-CH3OH, בהתאמה.ההזזה הגדולה של הסטוקס (כ-300 ננומטר) של RuDA מעידה על שינוי משמעותי בגיאומטריה של המצב הנרגש ועל היווצרות מצבים מעורבים באנרגיה נמוכה.התשואות הקוונטיות של הזוהר של עפרה ב-CH2Cl2 ו-CH3OH נקבעו כ-3.3 ו-0.6%, בהתאמה.עם זאת, בתערובת של מתנול ומים (5/95, v/v), נצפתה הסטה קלה לאדום של הפליטה וירידה בתפוקה הקוונטית (0.22%), אשר עשויה לנבוע מהרכבה עצמית של בצר. .
כדי לדמיין את ההרכבה העצמית של ORE, השתמשנו במיקרוסקופיה של כוח אטומי נוזלי (AFM) כדי לדמיין את השינויים המורפולוגיים ב-ORE בתמיסת מתנול לאחר הוספת מים.כאשר תכולת המים הייתה מתחת ל-80%, לא נצפתה צבירה ברורה (איור משלים 7).עם זאת, עם עלייה נוספת בתכולת המים ל-90-95%, הופיעו ננו-חלקיקים קטנים, אשר הצביעו על הרכבה עצמית של עפרה. בנוסף, קרינת לייזר באורך גל של 808 ננומטר לא השפיעה על עוצמת הספיגה של RuDA במימיות פתרון (איור 2C ואיור משלים 8).לעומת זאת, הספיגה של אינדוסיאנין ירוק (ICG כשליטה) ירדה במהירות ב-779 ננומטר, מה שמעיד על יציבות פוטו מצוינת של RuDA.בנוסף, היציבות של RuDA-NPs ב-PBS (pH = 5.4, 7.4 ו-9.0), 10% FBS ו-DMEM (גלוקוז גבוה) נבדקה על ידי ספקטרוסקופיה ספיגה של UV בנקודות זמן שונות.כפי שמוצג באיור משלים 9, שינויים קלים ברצועות הספיגה של RuDA-NP נצפו ב-PBS ב-pH 7.4/9.0, FBS ו-DMEM, מה שמצביע על יציבות מצוינת של RuDA-NP.עם זאת, במדיום חומצי (рН = 5.4) נמצאה הידרוליזה של עפרה.כמו כן, הערכנו עוד יותר את היציבות של RuDA ו-RuDA-NP באמצעות שיטות כרומטוגרפיה נוזלית עם ביצועים גבוהים (HPLC).כפי שמוצג באיור משלים 10, RuDA היה יציב בתערובת של מתנול ומים (50/50, v/v) במשך השעה הראשונה, והידרוליזה נצפתה לאחר 4 שעות.עם זאת, רק שיא קעור-קמור רחב נצפה עבור RuDA NPs.לכן, נעשה שימוש בכרומטוגרפיה של ג'ל (GPC) כדי להעריך את היציבות של RuDA NPs ב-PBS (pH = 7.4).כפי שמוצג באיור משלים 11, לאחר 8 שעות של דגירה בתנאים שנבדקו, גובה השיא, רוחב השיא ושטח השיא של NP RuDA לא השתנו באופן משמעותי, מה שמעיד על יציבות מצוינת של NP RuDA.בנוסף, תמונות TEM הראו שהמורפולוגיה של ננו-חלקיקי RuDA-NP נותרה כמעט ללא שינוי לאחר 24 שעות במאגר PBS מדולל (pH = 7.4, איור משלים. 12).
מכיוון שהרכבה עצמית יכולה להקנות מאפיינים פונקציונליים וכימיים שונים לעפר, ראינו שחרור של חומצה 9,10-anthracenediylbis(methylene)dimalonic (ABDA, אינדיקטור 1O2) בתערובות מתנול-מים.עפרה עם תכולת מים שונה 50.כפי שמוצג באיור 2D ובאיור משלים 13, לא נצפתה השפלה של ABDA כאשר תכולת המים הייתה מתחת ל-20%.עם עלייה בלחות ל-40%, התרחשה השפלה של ABDA, כפי שמעידה על ירידה בעוצמת הקרינה של ABDA.כמו כן, נצפה שתכולת מים גבוהה יותר גורמת לפירוק מהיר יותר, מה שמרמז שהרכבה עצמית של RuDA היא הכרחית ומועילה לפירוק ABDA.תופעה זו שונה מאוד מהכרומופורים המודרניים של ACQ (מצווה המושרה על ידי צבירה).כאשר מוקרנים בלייזר עם אורך גל של 808 ננומטר, התשואה הקוונטית של 1O2 RuDA בתערובת של 98% H2O/2% DMF היא 16.4%, שהוא פי 82 גבוה מזה של ICG (ΦΔ = 0.2%)51, מפגין יעילות ייצור יוצאת דופן 1O2 RuDA במצב צבירה.
ספינים של אלקטרונים באמצעות 2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinone (TEMP) ו-5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide (DMPO) כמלכודות ספין בספקטרוסקופיה תהודה (ESR) נעשה שימוש לזיהוי המינים שהתקבלו. AFK.מאת RuDA.כפי שמוצג באיור משלים 14, אושר כי 1O2 נוצר בזמני הקרנה בין 0 ל-4 דקות.בנוסף, כאשר RuDA הודגרה עם DMPO תחת הקרנה, זוהה אות EPR טיפוסי של 1:2:2:1 DMPO-OH· 1:2:2:1, המעיד על היווצרות רדיקלי הידרוקסיל (OH·).בסך הכל, התוצאות לעיל מדגימות את היכולת של RuDA לעורר ייצור ROS באמצעות תהליך פוטוסנסיטיזציה מסוג I/II כפול.
כדי להבין טוב יותר את התכונות האלקטרוניות של RuDA בצורות מונומריות ומצטברות, האורביטלים המולקולריים הגבוליים של RuDA בצורות מונומריות ודימריות חושבו בשיטת DFT.כפי שמוצג באיור.3A, האורביטל המולקולרי התפוס הגבוה ביותר (HOMO) של RuDA מונומרי מועבר לאורך עמוד השדרה של הליגנד והאורביטל המולקולרי הבלתי תפוס הנמוך ביותר (LUMO) מרוכז ביחידת המקבל TDP.להיפך, צפיפות האלקטרונים ב-HOMO הדימרית מרוכזת על הליגנד של מולקולת RuDA אחת, בעוד שצפיפות האלקטרונים ב-LUMO מתרכזת בעיקר ביחידת המקבל של מולקולת RuDA אחרת, מה שמעיד על כך ש-RuDA נמצא בדימר.תכונות של CT.
A ה-HOMO וה-LUMO של Ore מחושבים בצורות מונומריות ודימריות.B רמות אנרגיית ספיגה ושלישיה של עפרה במונומרים ודימרים.C רמות משוערות של RuDA וערוצי ISC אפשריים כמונומריים C ודימריים D. החצים מציינים ערוצי ISC אפשריים.
התפלגות האלקטרונים והחורים במצבים המעורבים באנרגיה נמוכה של RuDA בצורות המונומריות והדימריות נותחה באמצעות תוכנת Multiwfn 3.852.53, אשר חושבו בשיטת TD-DFT.כפי שמצוין על התווית הנוספת.כפי שמוצג באיורים 1-2, חורי RDA מונומריים מועברים לרוב לאורך עמוד השדרה של הליגנד במצבים נרגשים אלו של סינגל, בעוד שהאלקטרונים ממוקמים בעיקר בקבוצת TDP, מה שמדגים את המאפיינים התוך מולקולריים של CT.בנוסף, עבור מצבי סינגל נרגשים אלה, קיימת פחות או יותר חפיפה בין חורים ואלקטרונים, מה שמרמז על כך שמצבים מעורבים בסינגלט אלו תורמים תרומה מסוימת מעירור מקומי (LE).עבור דימרים, בנוסף לתכונות CT תוך-מולקולריות ו-LE, נצפה שיעור מסוים של תכונות CT בין-מולקולריות במצבים המתאימים, במיוחד S3, S4, S7 ו-S8, בהתבסס על ניתוח CT בין-מולקולרי, כאשר מעברים בין-מולקולריים ב-CT הם העיקריים. (טבלה משלימה).3).
כדי להבין טוב יותר את תוצאות הניסוי, חקרנו עוד את המאפיינים של מצבים נרגשים של RuDA כדי לחקור את ההבדלים בין מונומרים ודימרים (טבלאות משלימות 4-5).כפי שמוצג באיור 3B, רמות האנרגיה של מצבי הסינגלט והטריפלט הנרגשים של הדימר צפופות הרבה יותר מאלו של המונומר, מה שעוזר להפחית את פער האנרגיה בין S1 ל-Tn. דווח כי מעברי ISC יכולים להתממש בתוך פער אנרגיה קטן (ΔES1-Tn < 0.3 eV) בין S1 ל-Tn54. דווח כי מעברי ISC יכולים להתממש בתוך פער אנרגיה קטן (ΔES1-Tn < 0.3 eV) בין S1 ל-Tn54. Сообщалось, что переходы ISC могут быть реализованы в пределах небольшой энергетической щели (ΔES1-жn, ДES1-жн. דווח כי ניתן לממש מעברי ISC בתוך פער אנרגיה קטן (ΔES1-Tn <0.3 eV) בין S1 ל-Tn54.据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0.3 eV）内实现。据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0.3 eV）内实现。 Сообщалось, что переход ISC может быть реализован в пределах небольшой энергетической щели (Δиж0,-3n. דווח שניתן לממש את מעבר ה-ISC בתוך פער אנרגיה קטן (ΔES1-Tn < 0.3 eV) בין S1 ל-Tn54.בנוסף, רק מסלול אחד, תפוס או לא תפוס, חייב להיות שונה במצבי יחיד וטריפלט קשורים כדי לספק אינטגרל SOC שאינו אפס.לפיכך, בהתבסס על ניתוח אנרגיית העירור והמעבר המסלולי, כל הערוצים האפשריים של מעבר ISC מוצגים באיורים.3C,D.יש לציין, רק ערוץ ISC אחד זמין במונומר, בעוד שלצורה הדימרית יש ארבעה ערוצי ISC שיכולים לשפר את מעבר ISC.לכן, סביר להניח שככל שיצטברו יותר מולקולות RuDA, כך ערוצי ISC יהיו נגישים יותר.לכן, אגרגטים של RuDA יכולים ליצור מבנים אלקטרוניים דו-פסיים במצבי סינגל וטריפלט, להקטין את פער האנרגיה בין S1 ל-Tn זמין, ובכך להגדיל את היעילות של ISC כדי להקל על יצירת 1O2.
כדי להבהיר יותר את המנגנון הבסיסי, סנתזנו תרכובת ייחוס של קומפלקס arene-Ru(II) (RuET) על ידי החלפת שתי קבוצות אתיל בשתי קבוצות טריפנילאמין פניל ​​ב-RuDA (איור 4A, לאפיון מלא, ראה ESI, משלים 15 -21 ) מתורם (דיאתילאמין) למקבל (TDF), ל-RuET יש את אותם מאפייני CT תוך-מולקולריים כמו RuDA.כצפוי, ספקטרום הקליטה של ​​RuET ב-DMF הראה פס העברת מטען אנרגיה נמוך עם ספיגה חזקה באזור האינפרא אדום הקרוב באזור 600-1100 ננומטר (איור 4B).בנוסף, נצפתה צבירת RuET גם עם עלייה בתכולת המים, אשר באה לידי ביטוי בהסטה לאדום של מקסימום הספיגה, אשר אושרה עוד יותר על ידי הדמיית AFM נוזלית (איור משלים. 22).התוצאות מראות ש-RuET, כמו RuDA, יכול ליצור מצבים תוך-מולקולריים ולהרכיב את עצמם למבנים מצטברים.
מבנה כימי של RuET.B ספקטרום ספיגה של RuET בתערובות של יחסים שונים של DMF ומים.חלקות C EIS Nyquist עבור RuDA ו- RuET.תגובות Photocurrent D של RuDA ו- RuET תחת פעולת קרינת לייזר עם אורך גל של 808 ננומטר.
הפירוק הפוטו-דיגרציוני של ABDA בנוכחות RuET הוערך על ידי הקרנה בלייזר עם אורך גל של 808 ננומטר.באופן מפתיע, לא נצפתה השפלה של ABDA בשברי מים שונים (איור משלים. 23).סיבה אפשרית היא ש-RuET לא יכול ליצור ביעילות מבנה אלקטרוני עם פסים מכיוון ששרשרת האתיל אינה מקדמת העברת מטען בין-מולקולרית יעילה.לכן, בוצעו ספקטרוסקופיה עכבה אלקטרוכימית (EIS) ומדידות פוטו זרם חולף כדי להשוות את המאפיינים הפוטואלקטרוכימיים של RuDA ו- RuET.לפי העלילה של Nyquist (איור 4C), RuDA מראה רדיוס קטן בהרבה מ-RuET, מה שאומר של-RuDA56 יש הובלת אלקטרונים בין מולקולרית מהירה יותר ומוליכות טובה יותר.בנוסף, צפיפות הפוטו-זרם של RuDA גבוהה בהרבה מזו של RuET (איור 4D), מה שמאשר את יעילות העברת המטען הטובה יותר של RuDA57.לפיכך, קבוצת הפניל של טריפנילאמין בעפרה ממלאת תפקיד חשוב במתן העברת מטען בין-מולקולרית ויצירת מבנה אלקטרוני עם פסים.
כדי להגביר את הצטברות הגידול ואת התאימות הביולוגית in vivo, עטפנו עוד יותר את RuDA עם F127.הקוטר ההידרודינמי הממוצע של RuDA-NPs נקבע כ-123.1 ננומטר עם התפלגות צרה (PDI = 0.089) בשיטת פיזור אור דינמי (DLS) (איור 5A), אשר קידמה את הצטברות הגידול על ידי הגדלת החדירות והשמירה.אפקט EPR).תמונות TEM הראו כי ל- Ore NPs יש צורה כדורית אחידה בקוטר ממוצע של 86 ננומטר.יש לציין שמקסימום הספיגה של RuDA-NPs הופיע ב-800 ננומטר (איור משלים. 24), מה שמצביע על כך ש-RuDA-NPs עשויים לשמור על הפונקציות והמאפיינים של RuDAs בהרכבה עצמית.התשואה הקוונטית ROS המחושבת עבור NP Ore היא 15.9%, אשר ניתן להשוות ל-Ore. התכונות הפוטותרמיות של RuDA NPs נחקרו תחת פעולת קרינת לייזר עם אורך גל של 808 ננומטר באמצעות מצלמת אינפרא אדום.כפי שמוצג באיור.5B,C, קבוצת הביקורת (PBS בלבד) חוותה עלייה קלה בטמפרטורה, בעוד שהטמפרטורה של תמיסת RuDA-NPs עלתה במהירות עם עליית הטמפרטורה (ΔT) ל-15.5, 26.1 ו-43.0°C.ריכוזים גבוהים היו 25, 50 ו-100 µM, בהתאמה, מה שמעיד על השפעה פוטותרמית חזקה של RuDA NPs.בנוסף, מדידות מחזור חימום/קירור נלקחו כדי להעריך את היציבות הפוטותרמית של RuDA-NP ולהשוות עם ICG.הטמפרטורה של NPs בצר לא ירדה לאחר חמישה מחזורי חימום/קירור (איור 5D), מה שמעיד על היציבות הפוטותרמית המצוינת של NPs בצר.לעומת זאת, ICG מפגין יציבות פוטותרמית נמוכה יותר כפי שנראה מהיעלמות לכאורה של רמת הטמפרטורה הפוטותרמית באותם תנאים.לפי השיטה הקודמת58, יעילות ההמרה הפוטותרמית (PCE) של RuDA-NP חושבה כ-24.2%, שהוא גבוה יותר מחומרים פוטותרמיים קיימים כגון ננו-מוזהב (21.0%) וננו-קליפות זהב (13.0%)59.לפיכך, NP Ore מציגים תכונות פוטותרמיות מצוינות, מה שהופך אותם לסוכני PTT מבטיחים.
ניתוח של תמונות DLS ו-TEM של RuDA NPs (הוספה).B תמונות תרמיות של ריכוזים שונים של RuDA NPs שנחשפו לקרינת לייזר באורך גל של 808 ננומטר (0.5 W cm-2).C עקומות המרה פוטותרמיות של ריכוזים שונים של NPs עפר, שהם נתונים כמותיים.B.D עליית טמפרטורה של ORE NP ו-ICG על פני 5 מחזורי חימום-קירור.
פוטוציטוטוקסיות של RuDA NPs כנגד תאי סרטן שד אנושיים מסוג MDA-MB-231 הוערכה במבחנה.כפי שמוצג באיור.6A, B, RuDA-NPs ו-RuDA הפגינו ציטוטוקסיות זניחה בהיעדר הקרנה, מה שמרמז על רעילות כהה נמוכה יותר של RuDA-NPs ו-RuDA.עם זאת, לאחר חשיפה לקרינת לייזר באורך גל של 808 ננומטר, RuDA ו-RuDA NPs הראו פוטוציטוטוקסיות חזקה כנגד תאי סרטן MDA-MB-231 עם ערכי IC50 (ריכוז מעכב חצי מרבי) של 5.4 ו-9.4 מיקרומטר, בהתאמה, המדגימים. של-RuDA-NP ו-RuDA יש פוטנציאל לטיפול בפוטותרפיה בסרטן.בנוסף, הפוטוציטוטוקסיות של RuDA-NP ו-RuDA נחקרה עוד יותר בנוכחות ויטמין C (Vc), שואב ROS, כדי להבהיר את תפקידו של ROS בציטוטוקסיות הנגרמת על ידי אור.ברור שכדאיות התא עלתה לאחר הוספת Vc, וערכי ה-IC50 של RuDA ו- RuDA NPs היו 25.7 ו-40.0 מיקרומטר, בהתאמה, מה שמוכיח את התפקיד החשוב של ROS בפוטוציטוטוקסיות של RuDA ו- RuDA NPs.ציטוטוקסיות הנגרמת על ידי אור של RuDA-NPs ו-RuDA בתאי סרטן MDA-MB-231 על ידי צביעה של תאים חיים/מתים באמצעות calcein AM (קרינה ירוקה לתאים חיים) ו-propidium iodide (PI, פלואורסצנטי אדום לתאים מתים).מאומת על ידי תאים) כבדיקות פלורסנט.כפי שמוצג באיור 6C, תאים שטופלו ב-RuDA-NP או RuDA נותרו ברי קיימא ללא הקרנה, כפי שמעיד על ידי קרינה ירוקה עזה.להיפך, בהקרנת לייזר נצפתה רק פלואורסצנטי אדום, המאשר את הפוטוציטוטוקסיות היעילה של RuDA או RuDA NPs.ראוי לציין כי הקרינה הירוקה הופיעה עם הוספת Vc, מה שמעיד על הפרה של פוטוציטוטוקסיות של RuDA ו- RuDA NPs.תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם מבחני פוטוציטוטוקסיות במבחנה.
כדאיות תלוית מינון של תאי A RuDA- ו-B RuDA-NP בתאי MDA-MB-231 בנוכחות או היעדר Vc (0.5 mM), בהתאמה.פסי שגיאה, ממוצע ± סטיית תקן (n = 3). מבחני t לא מזווגים דו-צדדיים *p ​​< 0.05, **p < 0.01 ו-***p < 0.001. מבחני t לא מזווגים דו-צדדיים *p ​​< 0.05, **p < 0.01 ו-***p < 0.001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 ו-***p <0,001. מבחני t דו-זנב בלתי מזווגים *p<0.05, **p<0.01 ו-***p<0.001.未配对的双边t 检验*p < 0.05、**p < 0.01 和***p < 0.001.未配对的双边t 检验*p < 0.05、**p < 0.01 和***p < 0.001. Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 ו-***p <0,001. מבחני t דו-זנב בלתי מזווגים *p<0.05, **p<0.01 ו-***p<0.001.C ניתוח צביעה של תאים חיים/מתים באמצעות קלצין AM ו-propidium יודיד כבדיקות ניאון.סרגל קנה מידה: 30 מיקרומטר.מוצגות תמונות מייצגות של שלוש חזרות ביולוגיות מכל קבוצה.D תמונות פלואורסצנטי קונפוקאליות של ייצור ROS בתאי MDA-MB-231 בתנאי טיפול שונים.קרינת DCF ירוקה מעידה על נוכחות של ROS.הקרנה בלייזר באורך גל של 808 ננומטר בהספק של 0.5 W/cm2 למשך 10 דקות (300 J/cm2).סרגל קנה מידה: 30 מיקרומטר.מוצגות תמונות מייצגות של שלוש חזרות ביולוגיות מכל קבוצה.E Flow cytometry ניתוח טיפול RuDA-NPs (50 µM) או RuDA (50 µM) עם או בלי לייזר 808 ננומטר (0.5 W cm-2) בנוכחות והעדר Vc (0.5 מ"מ) למשך 10 דקות.מוצגות תמונות מייצגות של שלוש חזרות ביולוגיות מכל קבוצה.F Nrf-2, HSP70 ו-HO-1 של תאי MDA-MB-231 שטופלו ב-RuDA-NPs (50 µM) עם או בלי קרינת לייזר 808 ננומטר (0.5 W cm-2, 10 דקות, 300 J cm-2) , תאים מביעים 2).מוצגות תמונות מייצגות של שתי חזרות ביולוגיות מכל קבוצה.
ייצור ROS תוך תאי בתאי MDA-MB-231 נבדק בשיטת הצביעה 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA).כפי שמוצג באיור.6D, תאים שטופלו עם RuDA-NPs או RuDA הפגינו קרינה ירוקה מובהקת כשהוקרנו בלייזר 808 ננומטר, מה שמעיד על כך של-RuDA-NPs ו-RuDA יש יכולת יעילה ליצור ROS.להיפך, בהיעדר אור או בנוכחות Vc, נצפה רק אות פלואורסצנטי חלש של התאים, שהעיד על היווצרות קלה של ROS.רמות ROS תוך-תאיות בתאי RuDA-NP ובתאי MDA-MB-231 שטופלו ב-RuDA נקבעו עוד על ידי ציטומטריית זרימה.כפי שמוצג באיור משלים 25, עוצמת הקרינה הממוצעת (MFI) שנוצרה על ידי RuDA-NPs ו-RuDA תחת קרינת לייזר של 808 ננומטר גדלה באופן משמעותי בכפי 5.1 ו-4.8, בהתאמה, בהשוואה לקבוצת הביקורת, מה שמאשר את היווצרותם המצוינת AFK.קיבולת.עם זאת, רמות ROS תוך תאיות בתאי RuDA-NP או MDA-MB-231 שטופלו ב-RuDA היו דומות רק לבקרות ללא הקרנת לייזר או בנוכחות Vc, בדומה לתוצאות של ניתוח הקרינה הקונפוקלית.
הוכח שהמיטוכונדריה הן המטרה העיקרית של קומפלקסים של Ru(II)-aren60.לכן, הלוקליזציה התת-תאית של RuDA ו- RuDA-NPs נחקרה.כפי שמוצג באיור משלים 26, RuDA ו-RuDA-NP מציגים פרופילי הפצה תאי דומים עם ההצטברות הגבוהה ביותר במיטוכונדריה (62.5 ± 4.3 ו-60.4 ± 3.6 ננוגרם/מ"ג חלבון, בהתאמה).עם זאת, רק כמות קטנה של Ru נמצאה בשברים הגרעיניים של Ore ו-NP Ore (3.5 ו-2.1%, בהתאמה).חלק התאים הנותר הכיל רותניום שיורי: 31.7% (30.6 ± 3.4 ng/mg חלבון) עבור RuDA ו-42.9% (47.2 ± 4.5 ng/mg חלבון) עבור RuDA-NPs.באופן כללי, עפרה ו-NP Ore מצטברים בעיקר במיטוכונדריה.כדי להעריך תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, השתמשנו בצביעה של JC-1 ו- MitoSOX Red כדי להעריך את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ויכולת ייצור הסופראוקסיד, בהתאמה.כפי שמוצג באיור משלים. 27, קרינה ירוקה אינטנסיבית (JC-1) ואדומה (MitoSOX Red) נצפתה בתאים שטופלו הן ב-RuDA והן ב-RuDA-NPs תחת הקרנת לייזר של 808 ננומטר, מה שמצביע על כך שגם RuDA וגם RuDA-NPs ניאון גבוה. זה יכול לגרום ביעילות לדה-פולריזציה של הממברנה המיטוכונדריאלית וייצור סופראוקסיד.בנוסף, מנגנון המוות של התא נקבע באמצעות ניתוח מבוסס ציטומטריית זרימה של אנקסין V-FITC/פרופידיום יודיד (PI).כפי שמוצג באיור 6E, כשהוקרנו בלייזר 808 ננומטר, RuDA ו-RuDA-NP גרמו לשיעור אפופטוזיס מוקדם מוגבר באופן משמעותי (רבביע ימני תחתון) בתאי MDA-MB-231 בהשוואה ל-PBS או PBS בתוספת לייזר.תאים מעובדים.עם זאת, כאשר הוסף Vc, שיעור האפופטוזיס של RuDA ו-RuDA-NP ירד באופן משמעותי מ-50.9% ו-52.0% ל-15.8% ו-17.8%, בהתאמה, מה שמאשר את התפקיד החשוב של ROS בפוטוציטוטוקסיות של RuDA ו-RuDA-NP..בנוסף, תאים נמקיים קלים נצפו בכל הקבוצות שנבדקו (ברביע השמאלי העליון), מה שמצביע על כך שאפופטוזיס עשויה להיות הצורה השלטת של מוות תאים המושרה על ידי RuDA ו-RuDA-NPs.
מאחר שנזק של עקה חמצונית היא גורם מכריע לאפופטוזיס, הגורם הגרעיני הקשור לאריתרואיד 2, פקטור 2 (Nrf2) 62, מווסת מפתח של מערכת נוגדי החמצון, נחקר ב-MDA-MB-231 שטופלו ב- RuDA-NPs.מנגנון הפעולה של RuDA NPs המושרה על ידי הקרנה.במקביל, זוהה גם ביטוי של החלבון במורד הזרם heme oxygenase 1 (HO-1).כפי שמוצג באיור 6F ובאיור משלים 29, פוטותרפיה בתיווך RuDA-NP הגדילה את רמות הביטוי Nrf2 ו-HO-1 בהשוואה לקבוצת PBS, מה שמעיד על כך ש-RuDA-NPs עשויים לעורר מסלולי איתות של מתח חמצוני.בנוסף, כדי לחקור את ההשפעה הפוטותרמית של RuDA-NPs63, הוערך גם הביטוי של חלבון הלם החום Hsp70.ברור שתאים שטופלו ב- RuDA-NPs + הקרנת לייזר 808 ננומטר הראו ביטוי מוגבר של Hsp70 בהשוואה לשתי הקבוצות האחרות, מה שמשקף תגובה תאית להיפרתרמיה.
התוצאות המדהימות במבחנה הניעו אותנו לחקור את הביצועים in vivo של RuDA-NP בעכברים עירומים עם גידולי MDA-MB-231.התפלגות הרקמות של RuDA NPs נחקרה על ידי קביעת תכולת הרותניום בכבד, הלב, הטחול, הכליות, הריאות והגידולים.כפי שמוצג באיור.7A, התכולה המקסימלית של Ore NPs באיברים תקינים הופיעה בזמן התצפית הראשון (4 שעות), בעוד התכולה המקסימלית נקבעה ברקמות הגידול 8 שעות לאחר ההזרקה, אולי בגלל Ore NPs.אפקט EPR של LF.על פי תוצאות ההפצה, משך הטיפול האופטימלי בעפרות NP נלקח 8 שעות לאחר המתן.כדי להמחיש את תהליך הצטברות RuDA-NPs באתרי גידול, המאפיינים הפוטו-אקוסטיים (PA) של RuDA-NPs נוטרו על ידי רישום אותות PA של RuDA-NPs בזמנים שונים לאחר ההזרקה.ראשית, אות ה-PA של RuDA-NP in vivo הוערך על ידי הקלטת תמונות PA של אתר גידול לאחר הזרקה תוך-גידולית של RuDA-NP.כפי שמוצג באיור משלים 30, RuDA-NPs הראו אות PA חזק, והיה מתאם חיובי בין ריכוז RuDA-NP ועוצמת אות PA (איור משלים 30A).לאחר מכן, תמונות PA in vivo של אתרי גידול תועדו לאחר הזרקה תוך ורידית של RuDA ו- RuDA-NP בנקודות זמן שונות לאחר ההזרקה.כפי שמוצג באיור 7B, אות ה-PA של RuDA-NPs מאתר הגידול גדל בהדרגה עם הזמן והגיע לרמה ב-8 שעות לאחר ההזרקה, בהתאם לתוצאות הפצת רקמות שנקבעו על ידי ניתוח ICP-MS.ביחס ל-RuDA (איור משלים. 30B), עוצמת האות ה-PA המקסימלית הופיעה 4 שעות לאחר ההזרקה, מה שמצביע על קצב כניסה מהיר של RuDA לגידול.בנוסף, התנהגות ההפרשה של RuDA ושל RuDA-NPs נחקרה על ידי קביעת כמות הרותניום בשתן ובצואה באמצעות ICP-MS.מסלול החיסול העיקרי של RuDA (איור משלים. 31) ו- RuDA-NPs (איור 7C) הוא באמצעות הצואה, ופינוי יעיל של RuDA ו- RuDA-NPs נצפה במהלך תקופת המחקר של 8 ימים, כלומר RuDA. ו-RuDA-NPs עשויים להסיר ביעילות מהגוף ללא רעילות ארוכת טווח.
א. התפלגות Ex vivo של RuDA-NP ברקמות עכברים נקבעה על ידי תכולת Ru (אחוז מינון RuDA (ID) לגרם רקמה) בזמנים שונים לאחר ההזרקה.הנתונים הם ממוצע ± סטיית תקן (n = 3). מבחני t לא מזווגים דו-צדדיים *p ​​< 0.05, **p < 0.01 ו-***p < 0.001. מבחני t לא מזווגים דו-צדדיים *p ​​< 0.05, **p < 0.01 ו-***p < 0.001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 ו-***p <0,001. מבחני t דו-זנב בלתי מזווגים *p<0.05, **p<0.01 ו-***p<0.001.未配对的双边t 检验*p < 0.05、**p < 0.01 和***p < 0.001.未配对的双边t 检验*p < 0.05、**p < 0.01 和***p < 0.001. Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 ו-***p <0,001. מבחני t דו-זנב בלתי מזווגים *p<0.05, **p<0.01 ו-***p<0.001.תמונות B PA של אתרי גידול in vivo בגירוי של 808 ננומטר לאחר מתן תוך ורידי של RuDA-NPs (10 µmol kg-1) בנקודות זמן שונות.לאחר מתן תוך ורידי של RuDA NPs (10 µmol kg-1), C Ru הופרש מעכברים עם שתן וצואה במרווחי זמן שונים.הנתונים הם ממוצע ± סטיית תקן (n = 3).
יכולת החימום של RuDA-NP in vivo נחקרה בעכברים עירומים עם גידולי MDA-MB-231 ו-RuDA לשם השוואה.כפי שמוצג באיור.8A ואיור משלים. 32, קבוצת הבקרה (מי מלח) הראתה פחות שינויי טמפרטורה (ΔT ≈ 3°C) לאחר 10 דקות של חשיפה מתמשכת.עם זאת, הטמפרטורה של RuDA-NPs ו-RuDA עלתה במהירות עם טמפרטורות מקסימליות של 55.2 ו-49.9 מעלות צלזיוס, בהתאמה, מה שמספק היפרתרמיה מספקת לטיפול בסרטן in vivo.העלייה הנצפית בטמפרטורה הגבוהה עבור RuDA NPs (ΔT ≈ 24°C) בהשוואה ל-RuDA (ΔT ≈ 19°C) עשויה לנבוע מחדירות והצטברות טובה יותר שלו ברקמות הגידול עקב אפקט EPR.
תמונות תרמיות אינפרא אדום של עכברים עם גידולי MDA-MB-231 שהוקרנו בלייזר 808 ננומטר בזמנים שונים 8 שעות לאחר ההזרקה.מוצגות תמונות מייצגות של ארבע חזרות ביולוגיות מכל קבוצה.B נפח גידול יחסי ו-C מסת גידול ממוצעת של קבוצות שונות של עכברים במהלך הטיפול.D עקומות של משקלי גוף של קבוצות שונות של עכברים.הקרנה בלייזר באורך גל של 808 ננומטר בהספק של 0.5 W/cm2 למשך 10 דקות (300 J/cm2).פסי שגיאה, ממוצע ± סטיית תקן (n = 3). מבחני t לא מזווגים דו-צדדיים *p ​​< 0.05, **p < 0.01 ו-***p < 0.001. מבחני t לא מזווגים דו-צדדיים *p ​​< 0.05, **p < 0.01 ו-***p < 0.001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 ו-***p <0,001. מבחני t דו-זנב בלתי מזווגים *p<0.05, **p<0.01 ו-***p<0.001.未配对的双边t 检验*p < 0.05、**p < 0.01 和***p < 0.001.未配对的双边t 检验*p < 0.05、**p < 0.01 和***p < 0.001. Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 ו-***p <0,001. מבחני t דו-זנב בלתי מזווגים *p<0.05, **p<0.01 ו-***p<0.001. תמונות צביעת E H&E של איברים וגידולים עיקריים מקבוצות טיפול שונות, כולל מלוחים, מלוחים + לייזר, RuDA, RuDA + לייזר, RuDA-NPs וקבוצות RuDA-NPs + לייזר. תמונות צביעת E H&E של איברים וגידולים עיקריים מקבוצות טיפול שונות, כולל מלוחים, מלוחים + לייזר, RuDA, RuDA + לייזר, RuDA-NPs וקבוצות RuDA-NPs + לייזר. Изображения окрашивания E H&E основных органов и опухолей из разных групп лечения, включая группы физиологического раствора, физиологического раствора + лазера, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs и RuDA-NPs + Laser. תמונות צביעת E H&E של איברים וגידולים עיקריים מקבוצות טיפול שונות, כולל מלוחים, מלוחים + לייזר, RuDA, RuDA + לייזר, RuDA-NPs וקבוצות RuDA-NPs + לייזר.来自 不同 治疗 组 的 主要 器官 和 肿瘤 的 e h & e 染色 图像 ， 包括 盐水 、 盐 水 + 激光 、 ruda 、 ruda + 激光 、 ruda-nps 和 ruda 激光组。。。。。。。。。。。。 、来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E Окрашивание E H&E основных органов и опухолей из различных групп лечения, включая физиологический раствор, физиологический раствор + лазер, RuDA, RuDA + лазер, RuDA-NPs и RuDA-NPs + лазер. צביעת E H&E של איברים וגידולים עיקריים מקבוצות טיפול שונות כולל מלוחים, מלוחים + לייזר, RuDA, RuDA + לייזר, RuDA-NPs ו- RuDA-NPs + לייזר.סרגל קנה מידה: 60 מיקרומטר.
הוערכה ההשפעה של פוטותרפיה in vivo עם RuDA ו- RuDA NPs שבה עכברים עירומים עם גידולי MDA-MB-231 הוזרקו לווריד עם RuDA או RuDA NPs במינון בודד של 10.0 µmol kg-1 דרך וריד הזנב, ולאחר מכן 8 שעות לאחר ההזרקה.קרינת לייזר עם אורך גל של 808 ננומטר.כפי שמוצג באיור 8B, נפחי הגידול גדלו באופן משמעותי בקבוצות המלח והלייזר, מה שמצביע על כך שלקרינת מי מלח או לייזר 808 הייתה השפעה מועטה על צמיחת הגידול.כמו בקבוצת המלוחים, נצפתה צמיחה מהירה של גידולים גם בעכברים שטופלו ב-RuDA-NPs או RuDA בהיעדר הקרנת לייזר, מה שמוכיח את רעילותם הנמוכה בחושך.לעומת זאת, לאחר הקרנת לייזר, הטיפול ב-RuDA-NP וגם ב-RuDA גררו רגרסיה משמעותית של הגידול עם הפחתת נפח הגידול של 95.2% ו-84.3%, בהתאמה, בהשוואה לקבוצה שטופלה במי מלח, מה שמעיד על PDT סינרגטי מצוין., בתיווך אפקט RuDA/CHTV.– NP או Ore. בהשוואה ל-RuDA, RuDA NPs הראו אפקט פוטותרפי טוב יותר, שנבע בעיקר מהשפעת ה-EPR של RuDA NPs.תוצאות עיכוב צמיחת הגידול הוערכו עוד יותר על ידי משקל הגידול שנכרת ביום ה-15 של הטיפול (איור 8C ואיור משלים 33).מסת הגידול הממוצעת בעכברים שטופלו ב-RuDA-NP ובעכברים שטופלו ב-RuDA הייתה 0.08 ו-0.27 גרם, בהתאמה, שהיה קל בהרבה מאשר בקבוצת הביקורת (1.43 גרם).
בנוסף, משקל הגוף של עכברים תועד כל שלושה ימים כדי לחקור את הרעילות האפלה של RuDA-NPs או RuDA in vivo.כפי שמוצג באיור 8D, לא נצפו הבדלים משמעותיים במשקל הגוף בכל קבוצות הטיפול. יתר על כן, בוצע צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) של האיברים העיקריים (לב, כבד, טחול, ריאות וכליות) מקבוצות טיפול שונות. יתר על כן, בוצעו צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) של האיברים העיקריים (לב, כבד, טחול, ריאות וכליות) מקבוצות טיפול שונות. Кроме того, было проведено окрашивание гематоксилином и эозином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, печени, печни, печени, печени, печни, печени, печных בנוסף, בוצעה צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) של איברים מרכזיים (לב, כבד, טחול, ריאות וכליות) מקבוצות טיפול שונות.此外，对不同治疗组的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）辺和肾脏）迒眢缌脏 (הוא) Кроме того, проводили окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печенлином и эозином ) בנוסף, בוצעה צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) של איברים מרכזיים (לב, כבד, טחול, ריאות וכליות) בקבוצות טיפול שונות.כפי שמוצג באיור.8E, תמונות הצביעה של H&E של חמישה איברים עיקריים מקבוצות RuDA-NPs ו- RuDA לא מציגות חריגות ברורות או נזקים לאיברים. 8E, תמונות הצביעה של H&E של חמישה איברים עיקריים מקבוצות RuDA-NPs ו- RuDA לא מציגות חריגות ברורות או נזקים לאיברים.כפי שמוצג באיור.8E, изображения окрашивания H&E נותנת אופניים אורגנובים עם שרתים של RuDA-NPs ו-RuDA אינם מנוהלים מנוהלים. תמונות צביעת 8E, H&E של חמישה איברים עיקריים מקבוצות RuDA-NPs ו-RuDA לא מציגות חריגות או נגעים ברורים באיברים.如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E 染色图像没有显像没有显的夺帺如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E כיצד ניתן לקבל מידע על ריסון 8E, אוקראינה אוקראינה H&E נותנת מידע על אורגנובים עבור תוכנית RuDA-NPs ו-RuDA פנויה. כפי שמוצג באיור 8E, תמונות צביעת H&E של חמשת האיברים העיקריים מקבוצות RuDA-NPs ו- RuDA לא הראו חריגות ברורות או נזק לאיברים.תוצאות אלו הראו שלא RuDA-NP ולא RuDA לא הראו סימנים של רעילות in vivo. יתרה מזאת, תמונות צביעת H&E של גידולים הראו ששתי קבוצות RuDA + Laser ו- RuDA-NPs + Laser עלולות לגרום להרס חמור של תאי סרטן, מה שמדגים את היעילות הפוטותרפית המצוינת in vivo של RuDA ו- RuDA-NPs. יתרה מזאת, תמונות צביעת H&E של גידולים הראו ששתי קבוצות RuDA + Laser ו- RuDA-NPs + Laser עלולות לגרום להרס חמור של תאי סרטן, מה שמדגים את היעילות הפוטותרפית המצוינת in vivo של RuDA ו- RuDA-NPs.בנוסף, תמונות גידול מוכתמות המטוקסילין-אאוזין הראו ששתי קבוצות RuDA+Laser ו-RuDA-NPs+לייזר יכולות לגרום להרס חמור של תאים סרטניים, מה שמוכיח את היעילות הפוטותרפית המעולה של RuDA ו-RuDA-NPs in vivo.此外 ， 肿瘤 的 h & e 染色 图像 显示 ， Ruda + לייזר 和 Ruda-NP此外 ， 肿瘤 的 & e 染色 显示 ， Ruda + לייזר 和 Ruda-NP . . . .בנוסף, תמונות גידול מוכתמות המטוקסילין ו-eosin הראו ששתי קבוצות RuDA+Laser ו-RuDA-NPs+לייזר הביאו להרס חמור של תאים סרטניים, והדגימו יעילות פוטותרפית מעולה של RuDA ו-RuDA-NPs in vivo.
לסיכום, הקומפלקס האורגני מתכתי Ru(II)-arene (RuDA) עם ליגנדים מסוג DA תוכנן כדי להקל על תהליך ISC בשיטת הצבירה.RuDA מסונתז יכול להרכיב בעצמו באמצעות אינטראקציות לא קוולנטיות ליצירת מערכות על-מולקולריות שמקורן ב-RuDA, ובכך להקל על היווצרות 1O2 והמרה פוטותרמית יעילה לטיפול בסרטן המושרה באור.ראוי לציין ש-RuDA מונומרי לא יצר 1O2 תחת קרינת לייזר ב-808 ננומטר, אלא יכול ליצור כמות גדולה של 1O2 במצב מצטבר, מה שמדגים את הרציונליות והיעילות של התכנון שלנו.מחקרים שלאחר מכן הראו שההרכבה העל-מולקולרית מקנה ל-RuDA תכונות פוטו-פיזיקליות ופוטוכימיות משופרות, כגון קליטת הסחה לאדום ועמידות להלבנה בפוטו, הרצויות מאוד לעיבוד PDT ו-PTT.ניסויים חוץ-גופיים ו-in vivo הראו ש-RuDA NPs עם תאימות ביולוגית טובה והצטברות טובה בגידול מציגים פעילות אנטי-סרטנית מצוינת הנגרמת על ידי אור בהקרנת לייזר באורך גל של 808 ננומטר.לפיכך, RuDA NPs כריאגנטים סופרמולקולריים בי-מודאליים יעילים ל-PDT/PTW יעשירו את קבוצת הפוטוסנסייצירים המופעלים באורכי גל מעל 800 ננומטר.העיצוב הקונספטואלי של המערכת העל-מולקולרית מספק מסלול יעיל לפוטוסנסייצירים המופעלים על ידי NIR עם אפקטים מעולים של רגישות לפוטו.
כל הכימיקלים והממיסים התקבלו מספקים מסחריים והשתמשו בהם ללא טיהור נוסף.RuCl3 נרכש מחברת Boren Precious Metals Co., Ltd (Kunming, סין).[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (Fendio = 1,10-phenanthroline-5,6-dion) ו-4,7-bis[4-(N,N-diphenylamino)phenyl]-5 ,6-Diamino-2,1,3-Benzothiadiazole סונתז על פי מחקרים קודמים64,65.ספקטרום NMR תועדו בספקטרומטר Bruker Avance III-HD 600 מגה-הרץ במרכז הבדיקות האנליטיות של אוניברסיטת דרום-מזרח באמצעות d6-DMSO או CDCl3 כממס.שינויים כימיים δ ניתנים ב-ppm.ביחס ל-tetramethylsilane, וקבועי האינטראקציה J ניתנים בערכים מוחלטים בהרץ.ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה (HRMS) בוצעה על מכשיר Agilent 6224 ESI/TOF MS.ניתוח אלמנטים של C, H ו-N בוצע על מנתח אלמנטרי Vario MICROCHNOS (Elementar).ספקטרום הנראה ל-UV נמדדו בספקטרופוטומטר Shimadzu UV3600.ספקטרום הקרינה תועדו בספקטרופלואורמטר של Shimadzu RF-6000.ספקטרום EPR תועדו במכשיר Bruker EMXmicro-6/1.המורפולוגיה והמבנה של הדגימות המוכנות נחקרו במכשירי FEI Tecnai G20 (TEM) ו-Bruker Icon (AFM) הפועלים במתח של 200 קילו וולט.פיזור אור דינמי (DLS) בוצע על מנתח Nanobrook Omni (Brookhaven).תכונות פוטו-אלקטרוכימיות נמדדו במערך אלקטרוכימי (CHI-660, סין).תמונות פוטו-אקוסטיות התקבלו באמצעות מערכת FUJIFILM VisualSonics Vevo® LAZR.תמונות קונפוקאליות התקבלו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי של Olympus FV3000.ניתוח FACS בוצע על ציטומטר זרימה של BD Calibur.ניסויים בכרומטוגרפיה נוזלית בביצועים גבוהים (HPLC) בוצעו על מערכת Waters Alliance e2695 באמצעות גלאי UV/Vis 2489.בדיקות כרומטוגרפיה של ג'ל (GPC) תועדו על מכשיר Thermo ULTIMATE 3000 באמצעות גלאי מקדם שבירה ERC RefratoMax520.
[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-phenanthroline-5,6-dion)64 (481.0 מ"ג, 1.0 mmol), 4,7-bis[4 -(N, N-diphenylamino)phenyl]-5,6-diamino-2,1,3-benzothiadiazole 65 (652.0 מ"ג, 1.0 ממול) וחומצה קרחונית (30 מ"ל) נערבלו במקרר ריפלוקס למשך 12 שעות.לאחר מכן הוסר הממס בוואקום באמצעות מאייד סיבובי.השאריות שהתקבלו טוהרו על ידי כרומטוגרפיה של עמודת הבזק (סיליקה ג'ל, CH2Cl2:MeOH=20:1) לקבלת RuDA כאבקה ירוקה (תשואה: 877.5 מ"ג, 80%).פִּי הַטַבַּעַת.מחושב עבור C64H48Cl2N8RuS: C 67.84, H 4.27, N 9.89.נמצא: C 67.92, H 4.26, N 9.82.1H NMR (600 מגה-הרץ, d6-DMSO) δ 10.04 (s, 2H), 8.98 (s, 2H), 8.15 (s, 2H), 7.79 (s, 4H), 7.44 (s, 8H), 7.21 (d, J = 31.2 הרץ, 16H), 6.47 (s, 2H), 6.24 (s, 2H), 2.69 (s, 1H), 2.25 (s, 3H), 0.99 (s, 6H).13C NMR (150 מגה הרץ, D6-DMSO), Δ (PPM) 158.03, 152.81, 149.31, 147.98, 147.16, 139.98, 136.21, 135.57, 134.68, 130.34, 130.02, 128.68, 125.51, 125.44, 125.9, 125.8, 125.8, 125.81, 125.81, 125.81, 125.81, 125.81, 125., 125., 125., 125., 125., 125., 125., 125., 123. , 103. , 86.52, 84.75, 63.29, 30.90, 22.29, 18.83.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 1097.25.
סינתזה של 4,7-bis[4-(N,N-diethylamino)phenyl-5,6-diamino-2,1,3-benzothiadiazole (L2): L2 סונתז בשני שלבים.Pd(PPh3)4 (46 מ"ג, 0.040 מילימול) נוספה לתמיסת N,N-דיאתיל-4-(טריבוטילסטאניל)אנילין (1.05 גרם, 2.4 ממול) ותמיסת 4,7-דיברומו-5,6-דיניטרו - 2, 1,3-בנזותיאדיאזול (0.38 גרם, 1.0 ממול) בטולואן יבש (100 מ"ל).התערובת עורבלה ב-100 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.לאחר הסרת הטולואן בוואקום, המוצק שנוצר נשטף עם אתר נפט.לאחר מכן ערבבה תערובת של תרכובת זו (234.0 מ"ג, 0.45 מ"ל) ואבקת ברזל (0.30 גרם, 5.4 מ"ל) בחומצה אצטית (20 מ"ל) ב-80 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.תערובת התגובה נשפכה למים והמוצק החום שנוצר נאסף על ידי סינון.המוצר טוהר פעמיים על ידי סובלימציה ואקום כדי לתת מוצק ירוק (126.2 מ"ג, 57% תשואה).פִּי הַטַבַּעַת.מחושב עבור C26H32N6S: C 67.79, H 7.00, N 18.24.נמצא: C 67.84, H 6.95, H 18.16.1H NMR (600 MHz, CDCl3), δ (ppm) 7.42 (d, 4H), 6.84 (d, 4H), 4.09 (s, 4H), 3.42 (d, 8H), 1.22 (s, 12H).NMR 13C (150 מגה-הרץ, CDCl3), δ (ppm) 151.77, 147.39, 138.07, 131.20, 121.09, 113.84, 111.90, 44.34, 12.77.ESI-MS: m/z [M+H]+ = 461.24.
תרכובות הוכנו וטיהרו בעקבות נהלים דומים ל-RuDA.פִּי הַטַבַּעַת.מחושב עבור C48H48Cl2N8RuS: C 61.27, H 5.14, N 11.91.נמצא: C, 61.32, H, 5.12, N, 11.81, 1H NMR (600 MHz, d6-DMSO), δ (ppm) 10.19 (s, 2H), 9.28 (s, 2H), 8.09 (s, 2H), 7.95 (s, 4H), 6.93 (s, 4H), 6.48 (d, 2H), 6.34 (s, 2H), 3.54 (t, 8H), 2.80 (m, 1H), 2.33 (s, 3H), 1.31 (t, 12H), 1.07 (s, 6H).13C NMR (151 מגה הרץ, CDCL3), Δ (PPM) 158.20, 153.36, 148.82, 148.14, 138.59, 136.79, 135.75, 134.71, 130.44, 128.87, 128.35, 121.70, 111.84, 105.0, 105.0, 105.07, 105.07, 105.07, 105.07, 105.07, 105.07, 105.044., 38.06, 31.22, 29.69, 22.29, 19.19, 14.98, 12.93.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 905.24.
RuDA הומס ב-MeOH/H2O (5/95, v/v) בריכוז של 10 מיקרומטר.ספקטרום הקליטה של ​​RuDA נמדד כל 5 דקות בספקטרופוטומטר Shimadzu UV-3600 תחת הקרנה באור לייזר באורך גל של 808 ננומטר (0.5 W/cm2).ספקטרום ה-ICG תועדו באותם תנאים כמו התקן.
ספקטרום ה-EPR תועדו בספקטרומטר Bruker EMXmicro-6/1 עם הספק מיקרוגל של 20 mW, טווח סריקה של 100 G ואפנון שדה של 1 G. 2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidon (TEMP) ו-5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide (DMPO) שימשו כמלכודות ספין.ספקטרום תהודה של ספין אלקטרוני תועדו עבור פתרונות מעורבים של RuDA (50 מיקרומטר) ו-TEMF (20 מ"מ) או DMPO (20 מ"מ) תחת פעולת קרינת לייזר עם אורך גל של 808 ננומטר (0.5 W/cm2).
חישובי DFT ו-TD-DFT עבור RuDA בוצעו ברמות PBE1PBE/6-31 G*//LanL2DZ בתמיסה מימית באמצעות תוכנית גאוס 1666,67,68.התפלגויות ה-HOMO-LUMO, החור והאלקטרונים של המצב הנמרץ של יחידת אנרגיה נמוכה RuDA שורטטו באמצעות תוכנית GaussView (גרסה 5.0).
תחילה ניסינו למדוד את יעילות היצירה של 1O2 RuDA באמצעות ספקטרוסקופיה רגילה של UV גלוי עם ICG (ΦΔ = 0.002) כסטנדרט, אך הפירוק הפוטו-דיגרדציה של ICG השפיע מאוד על התוצאות.לפיכך, התשואה הקוונטית של 1O2 RuDA נמדדה על ידי זיהוי שינוי בעוצמת הקרינה של ABDA בכ-428 ננומטר בהקרנה בלייזר באורך גל של 808 ננומטר (0.5 W/cm2).ניסויים בוצעו על RuDA ו-RuDA NPs (20 מיקרומטר) במים/DMF (98/2, v/v) המכילים ABDA (50 מיקרומטר).התשואה הקוונטית של 1O2 חושבה באמצעות הנוסחה הבאה: ΦΔ (PS) = ΦΔ (ICG) × (rFS/APS)/(rICG/AICG).rPS ו- rICG הם שיעורי התגובה של ABDA עם 1O2 המתקבלים מהפוטוסנסיטיזר ו-ICG, בהתאמה.APS ו-AICG הם הספיגה של הפוטוסנסיטיזר ו-ICG ב-808 ננומטר, בהתאמה.
מדידות AFM בוצעו בתנאי נוזל באמצעות מצב הסריקה במערכת Bruker Dimension Icon AFM.באמצעות מבנה פתוח עם תאים נוזליים, התאים נשטפו פעמיים באתנול ויובשו בזרם חנקן.הכנס את התאים היבשים לראש האופטי של המיקרוסקופ.מניחים מיד טיפה מהדגימה לתוך בריכת הנוזלים ומניחים אותה על הזרוע באמצעות מזרק פלסטיק חד פעמי סטרילי ומחט סטרילית.טיפה נוספת מונחת ישירות על הדגימה, וכאשר הראש האופטי מוריד, שתי הטיפות מתמזגות ויוצרות מניסקוס בין הדגימה למאגר הנוזל.מדידות AFM בוצעו באמצעות שלוחה ניטריד בצורת SCANASYST-FLUID V (Bruker, קשיות k = 0.7 N m-1, f0 = 120-180 קילו-הרץ).
כרומטוגרמות HPLC התקבלו על מערכת Waters e2695 המצוידת בעמודת עוף החול C18 (250×4.6 מ"מ, 5 מיקרומטר) באמצעות גלאי UV/Vis 2489.אורך הגל של הגלאי הוא 650 ננומטר.שלבים ניידים A ו-B היו מים ומתנול, בהתאמה, וקצב זרימת הפאזה הניידת היה 1.0 ml·min-1.הגרדיאנט (ממס B) היה כדלקמן: 100% מ-0 עד 4 דקות, 100% עד 50% מ-5 עד 30 דקות, ואיפוס ל-100% מ-31 עד 40 דקות.עפרה הומסה בתמיסה מעורבת של מתנול ומים (50/50, לפי נפח) בריכוז של 50 מיקרומטר.נפח ההזרקה היה 20 μl.
מבחני GPC נרשמו במכשיר Thermo ULTIMATE 3000 המצויד בשתי עמודות PL aquagel-OH MIXED-H (2×300×7.5 מ"מ, 8 מיקרומטר) וגלאי מקדם שבירה ERC RefratoMax520.עמודת ה-GPC נחלה עם מים בקצב זרימה של 1 מ"ל לדקה ב-30 מעלות צלזיוס.NPs עפרות הומסו בתמיסת PBS (pH = 7.4, 50 מיקרומטר), נפח ההזרקה היה 20 μL.
זרמי פוטו נמדדו במערך אלקטרוכימי (CHI-660B, סין).התגובות האופטואלקטרוניות כאשר הלייזר הופעל וכיבוי (808 ננומטר, 0.5 W/cm2) נמדדו במתח של 0.5 V בקופסה שחורה, בהתאמה.נעשה שימוש בתא סטנדרטי בן שלוש אלקטרודות עם אלקטרודת פחמן מזכוכית בצורת L (GCE) כאלקטרודת עבודה, אלקטרודת קלומלית רגילה (SCE) כאלקטרודת ייחוס ודיסק פלטינה כאלקטרודת נגד.תמיסת 0.1 M Na2SO4 שימשה כאלקטרוליט.
קו תאי סרטן השד האנושי MDA-MB-231 נרכש מ-KeyGEN Biotec Co., LTD (Nanjing, סין, מספר קטלוגי: KG033).תאים גודלו בשכבות מונו-שכבות ב-Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, גבוה גלוקוז) בתוספת תמיסה של 10% סרום בקר עוברי (FBS), פניצילין (100 מיקרוגרם/מ"ל) וסטרפטומיצין (100 מיקרוגרם/מ"ל).כל התאים תורבו ב-37 מעלות צלזיוס באווירה לחה המכילה 5% CO2.
בדיקת MTT שימשה לקביעת הציטוטוקסיות של RuDA ו- RuDA-NPs בנוכחות והעדר הקרנת אור, עם או בלי Vc (0.5 mM).תאי סרטן MDA-MB-231 גודלו בצלחות של 96 בארות בצפיפות תאים של כ-1 x 105 תאים/מ"ל/באר והודגרו במשך 12 שעות ב-37.0 מעלות צלזיוס באווירה של 5% CO2 ו-95% אוויר.לתאים נוספו RuDA ו-RuDA NPs מומסים במים.לאחר 12 שעות של דגירה, התאים נחשפו לקרינת לייזר של 0.5 W cm -2 באורך גל של 808 ננומטר למשך 10 דקות (300 J cm -2) ולאחר מכן הודגרו בחושך למשך 24 שעות.התאים הודגרו עם MTT (5 מ"ג/מ"ל) למשך 5 שעות נוספות.לבסוף, שנה את המדיום ל-DMSO (200 μl) כדי להמיס את גבישי הפורמזן הסגולים שהתקבלו.ערכי OD נמדדו באמצעות קורא microplate עם אורך גל של 570/630 ננומטר.ערך IC50 עבור כל דגימה חושב באמצעות תוכנת SPSS מתוך עקומות מינון-תגובה שהתקבלו משלושה ניסויים עצמאיים לפחות.
תאי MDA-MB-231 טופלו עם RuDA ו-RuDA-NP בריכוז של 50 מיקרומטר.לאחר 12 שעות של דגירה, התאים הוקרנו בלייזר באורך גל של 808 ננומטר והספק של 0.5 W/cm2 למשך 10 דקות (300 J/cm2).בקבוצת ויטמין C (Vc), התאים טופלו ב-0.5 mM Vc לפני הקרנת לייזר.לאחר מכן התאים הודגרו בחושך למשך 24 שעות נוספות, לאחר מכן נצבעו ב- calcein AM ו-propidium iodide (20 מיקרוגרם/מ"ל, 5 μl) למשך 30 דקות, ולאחר מכן נשטפו עם PBS (10 μl, pH 7.4).תמונות של תאים מוכתמים.