חֲדָשׁוֹת

תודה שביקרת ב-Nature.com.לגרסת הדפדפן שבה אתה משתמש יש תמיכת CSS מוגבלת.לקבלת החוויה הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או להשבית את מצב תאימות ב-Internet Explorer).בינתיים, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, נעבד את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
תאים סרטניים פיתחו מנגנונים שונים כדי להתגבר על מתח תאי ולהמשיך להתקדם.חלבון קינאז R (PKR) ומפעיל החלבון שלו (PACT) הם המגיבים הראשוניים המנטרים אותות מתח שונים המובילים לעיכוב של שגשוג תאים ואפופטוזיס.עם זאת, הוויסות של מסלול PACT-PKR בתאי סרטן נותר לא ידוע במידה רבה.כאן, מצאנו כי RNA ארוך שאינו מקודד (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) מעורב ישירות בעיכוב של מסלול PACT-PKR ומקדם שגשוג תאי סרטן.באמצעות סקר תפקודי בקנה מידה גדול של lncRNA הקשור לסרטן CRISPRi 971, מצאנו ש-DARS-AS1 קשור לשגשוג מוגבר משמעותית של תאי סרטן.לכן, נוקאאוט DARS-AS1 מעכב שגשוג תאים ומקדם אפופטוזיס של תאים סרטניים בשורות תאים סרטניים שונות במבחנה ומפחית באופן משמעותי את צמיחת הגידול in vivo.מבחינה מכנית, DARS-AS1 נקשר ישירות לתחום ההפעלה של PACT ומונע אינטראקציה של PACT-PKR, ובכך מפחית את הפעלת PKR, זרחון eIF2α ועיכוב מוות של תאים אפופטוטיים.מבחינה קלינית, DARS-AS1 מתבטא באופן נרחב במספר סוגי סרטן, וביטוי יתר של lncRNA זה מעיד על פרוגנוזה גרועה.מחקר זה מבהיר ויסות ספציפי לסרטן של מסלול PACT-PKR על ידי DARS-AS1 lncRNA ומספק יעד נוסף לפרוגנוזה וטיפול בסרטן.
היכולת להסתגל ללחץ היא מאפיין חשוב להישרדות ותאי סרטן.ההתפשטות המהירה וסימני ההיכר המטבוליים של סרטן מגיעים לשיא במיקרו-סביבות קשות - מניעת חומרים מזינים, היפוקסיה ו-pH נמוך - שיכולות לעורר מסלולי איתות של מוות תאי.חוסר ויסות של גנים רגישים ללחץ כמו p535, חלבוני הלם חום 6, 7, KRAS8, 9 ו-HIF-110, 11, 12, 13 נצפה לעתים קרובות בסרטן, ובכך חוסם אפופטוזיס ומקדם הישרדות.
חלבון קינאז R (PKR) הוא חיישן מתח ותת-יחידת קינאז חשוב של גורם התחלה אוקריוטי 2α (eIF2α), מווסת תרגום המקשר בין מתח תאי למוות של תאים.PKR זוהה במקור כחלבון אנטי ויראלי על ידי זיהוי של RNA דו-גדילי זר (dsRNA).עם ההפעלה, PKR מזרחן את eIF2α כדי לעכב סינתזת חלבון ויראלי ותאי14,15,16.PACT (PKR activator protein) זוהה כחלבון המפעיל הראשון של PKR בהיעדר dsRNA17,18,19,20,21,22,23.באמצעות אינטראקציה ישירה עם PKR, PACT מעביר מתחים שונים (הרעבה בסרום, טיפול בפרוקסיד או ארסניט) ל-PKR ולמסלולי איתות במורד הזרם.בנוסף לזרחון eIF2α, הפעלת PKR בתיווך PACT מפעילה אירועים שונים הקשורים לתגובת הלחץ, כולל שינוי בסטטוס החיזור דרך מסלול PI3K/Akt24, בדיקת נזקי DNA משופרת באמצעות p5325,26 ו-NF-κB27,28 מווסתת שעתוק, 29. בהתחשב בתפקידם הקריטי בתגובת לחץ, התפשטות, אפופטוזיס ותהליכים תאיים מרכזיים אחרים, PKR ו-PACT הם יעדים טיפוליים מבטיחים למחלות רבות, במיוחד סרטן30,31,32,33.עם זאת, למרות המשמעות הפונקציונלית והביולוגית הפליוטרופית הזו, הוויסות של פעילות PACT/PKR בתאי סרטן נותר חמקמק.
lncRNAs הם תעתיקים גדולים מ-200 נוקלאוטידים ללא פוטנציאל קידוד חלבון.מאז פרויקטים חדשניים של רצף גנום שלם זיהו אלפי lncRNAs,35,36 נעשה מאמצים רבים כדי להבהיר את הפונקציות הביולוגיות שלהם.גוף גדל והולך של מחקרים הראה ש-lncRNAs מעורבים בתהליכים ביולוגיים רבים37 כולל ויסות השבתת כרומוזום X38,39, הטבעה40, שעתוק41,42, תרגום43 ואפילו צמיחת סרטן44,45,46,47.מחקרים אלו דיווחו כי lncRNAs רבים מעורבים במסלול PACT/PKR.מחקר אחד כזה הראה כי lncRNA ASPACT עיכב את שעתוק PACT והגביר את השמירה הגרעינית של PACT mRNA.מחקרים אחרים הראו כי lncRNA nc886 נקשר ל-PKR ומעכב את הזרחון שלו49,50.עד כה, לא דווח על lncRNA המווסת הפעלת PKR בתיווך PACT.
Aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) זוהה כ-lncRNA51,52,53,54 אונקוגני.באמצעות הרגולציה של miP-194-5p53, miP-12952 ו-miP-532-3p51, הוכח כי DARS-AS1 מקדם את הצמיחה של קרצינומה של תאי כליה ברורים, קרצינומה של בלוטת התריס וקרצינומה של תאים לא קטנים, בהתאמה.טונג ועמיתיו מצאו גם ש-DARS-AS1 מקדם התקדמות מיאלומה על ידי שמירה על היציבות של מוטיב קושר ה-RNA של חלבון 39 (RBM39).עם זאת, לא נערכו מחקרים האם lncRNA זה מעורב בוויסות של הפעלת PACT-PKR ותגובת הלחץ של תאים סרטניים.
כאן, ביצענו מסך בקנה מידה גדול של אובדן תפקוד באמצעות מערכת CRISPRi וקבענו ש-DARS-AS1 lncRNA מקדם את התפשטותם של מספר סוגים של תאים סרטניים.בנוסף, זיהינו מנגנון עיקרי: DARS-AS1 נקשר ישירות ל-PACT, מעכב קישור PACT ו-PKR, מונע זרחון של eIF2α, מצע PKR נמוך יותר, ובסופו של דבר מעכב מוות של תאים אפופטוטיים.לסיכום, עבודתנו חושפת את ה-DARS-AS1 lncRNA כמווסת של מסלול PACT-PKR ומטרה פוטנציאלית לטיפול ולפרוגנוזה בסרטן.
מחקרי פרופיל גנומי נרחבים זיהו מאות lncRNAs הקשורים לסרטן.עם זאת, תפקידם נותר ברובו לא ידוע56.כדי לזהות מועמדים מבטיחים ל-lncRNA המעורבים בהתקדמות הסרטן, ביצענו מסך אובדן תפקוד להפחתת התפשטות בקו תאי סרטן המעי הגס SW620 באמצעות מערכת CRISPRi (איור 1a).התכונה הייחודית של שורות תאי סרטן המעי הגס SW480 ו-SW620 היא שהם נגזרים מגידולים ראשוניים ומשניים בחולה בודד.זה מספק השוואה חשובה לחקר שינויים גנטיים בהתקדמות של סרטן המעי הגס מתקדם.לכן, ניתחנו את התעתיקים של שורות תאים סרטן המעי הגס (SW480 ו-SW620) באמצעות רצף RNA ואספנו כמה lncRNA פונקציונליים פוטנציאליים מהספרות שפורסמה.בהתבסס על תוצאות אלה, עיצבנו ספריית sgRNA מאוחדת המכילה 7355 אוליגו sgRNA המכוונים ל-971 lncRNAs הקשורים לסרטן ו-500 אוליגוים sgRNA לא ממוקדים לבקרה שלילית (נתונים משלימים 1).
ייצוג סכמטי של ההקרנה באמצעות מערכת CRISPRi.b העשרת sgRNA לאחר הקרנה.הקו המקווקו האופקי מייצג log2 (שינוי קיפול) = ±0.58.הקו המקווקו האנכי מציין ערך p = 0.05.נקודות שחורות מייצגות sgRNA שאינו יעד (המוגדר כ-NC).נקודות אדומות הן sgRNA המכוונות ל-DARS-AS1.נקודות כחולות הן sgRNAs המכוונות ל-LINC00205, lncRNA אונקוגני שתואר קודם לכן.שינוי קיפול = (קריאה מנורמלת, יום 17)/(קריאה מנורמלת, יום 0).c נוק-דאון DARS-AS1 sgRNA עיכב את צמיחת התאים.פסי שגיאה מייצגים ± סטיית תקן של שלושת הניסויים.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 מבחן t של תלמיד דו-זנב.ד ביטוי DARS-AS1 בגידולים (מערך נתונים של TCGA).em ביטוי של DARS-AS1 בדגימות נורמליות וגידוליות מזווגות מחולים עם BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP ו-COAD, בהתאמה (מערך נתונים של TCGA).ערכי p התקבלו באמצעות מבחן t של סטודנט דו-זנב זוגי.
לאחר בניית הפלסמיד ואריזת ה-lentivirus, הצגנו את קו תאי סרטן המעי הגס dCas9-SW620 עם הספרייה שלעיל בארבעה ניסויי זיהום עצמאיים.ריבוי הזיהום (MOI) עבור זיהומים אלו היה 0.1-0.3, מה שמצביע על כך שניתן להעביר כל תא רק עם sgRNA אחד.לאחר 18 ימים של תרבית חוץ גופית, פרופיל ההעשרה של sgRNAs מטרה ירד או עלה לאחר ההקרנה, בעוד שמספר אוליגונוקלאוטידים בקרה שאינם ממוקדים נותר ללא שינוי יחסית בהשוואה לפרופיל שלפני ההקרנה, מה שמצביע על כך שלמטרה שלנו יש מאפיינים ספציפיים מאוד למסך סִפְרִיָה.אורז.1ב וטבלה משלימה 1). LINC00205, שדווח בעבר כמקדם סרטן ריאות והתקדמות סרטן הכבד58,59,60, נבדק (log2 (שינוי פיפול) <-0.58, ערך p <0.05), המאשר את מהימנות ההקרנה הזו (איור 1ב). LINC00205, שדווח בעבר כמקדם סרטן ריאות והתקדמות סרטן הכבד58,59,60, נבדק (log2 (שינוי פיפול) <-0.58, ערך p <0.05), המאשר את מהימנות ההקרנה הזו (איור 1ב). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1ב). LINC00205, שדווח בעבר כמקדם התקדמות של סרטן ריאות וסרטן כבד 58,59,60, לא נכלל (log2 (שינוי קיפול) <-0.58, ערך p <0.05), מה שמאשר את החוסן של בדיקה זו (איור .1b) . LINC00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 log2 （倍数）） <-0.58 ， P 值 <0.05 Å LINC00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 log2 （倍数）） <-0.58 ， P 值 <0.05 Å LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1ב). LINC00205, שדווח בעבר כמקדם התקדמות של סרטן ריאות וכבד 58,59,60, לא נכלל (log2 (שינוי קיפול) <-0.58, ערך p <0.05), המאשר את חוסנה של בדיקה זו (איור .1b).
בין כל ה-lncRNAs שנבדקו, נבדק גם DARS-AS1, כאשר שלושת אוליגונוקלאוטידים של sgRNA נלווים הצטמצמו באופן משמעותי לאחר 18 ימי תרבית, דבר המצביע על כך שדפוס ה-lncRNA הזה הביא להפחתת התפשטות הסרטן (איור 1b).תוצאה זו נתמכה עוד יותר על ידי ניתוח MTS בתאי סרטן המעי הגס שהראה כי קצב הצמיחה של תאי נוק-דאון DARS-AS1 ירד רק בחצי בהשוואה לתאי בקרה (איור 1c) והיה עקבי עם דיווחים קודמים על מספר סוגי סרטן אחרים.: סרטן כליות צלולים, סרטן בלוטת התריס וסרטן ריאות של תאים לא קטנים51,52,53,55.עם זאת, תפקודו והמנגנונים המולקולריים שלו בסרטן המעי הגס נותרים בלתי נחקרים.לכן, בחרנו ב-lncRNA זה למחקר נוסף.
כדי לחקור את ביטוי DARS-AS1 בחולים, ניתחנו באופן מקיף 10,327 דגימות גידול מפרויקט Cancer Genome Atlas (TCGA).התוצאות שלנו מראות ש-DARS-AS1 מתבטא באופן נרחב ומווסת באופן משמעותי בתאים בריאים במגוון גידולים, כולל אדנוקרצינומה של המעי הגס (COAD), קרצינומה של תאים ברורים כליות (KIRC) וקרצינומה של תאי פפילרי כליות (KIRP)..מעט מאוד (איור 1ד ואיור משלים 1a, ב). ניתוח של דגימות בריאות/גידול זוגיות אישר עוד יותר ביטוי גבוה יותר משמעותית של DARS-AS1 בגידולים של קרצינומה של שלפוחית ​​​​השתן (BLCA), קרצינומה של תאי כליות צלולים (KIRC), אדנוקרצינומה של הערמונית (PRAD), קרצינומה של תאי קשקש בריאה (LUSC) , קרצינומה של רירית הרחם (UCEC), אדנוקרצינומה של הריאה (LUAD), קרצינומה של כבד כבד (LIHC), קרצינומה של תאי פפילרי כליות (KIRP), ואדנוקרצינומה של המעי הגס (COAD) (ערך p < 0.05) (איור 1e–m) . ניתוח של דגימות בריאות/גידול זוגיות אישר עוד יותר ביטוי גבוה יותר משמעותית של DARS-AS1 בגידולים של קרצינומה של שלפוחית ​​​​השתן (BLCA), קרצינומה של תאי כליות צלולים (KIRC), אדנוקרצינומה של הערמונית (PRAD), קרצינומה של תאי קשקש בריאה (LUSC) , קרצינומה של רירית הרחם (UCEC), אדנוקרצינומה של הריאה (LUAD), קרצינומה של כבד כבד (LIHC), קרצינומה של תאי פפילרי כליות (KIRP), ואדנוקרצינומה של המעי הגס (COAD) (ערך p < 0.05) (איור 1e–m) .ניתוח של דגימות בריאות/גידול מזווגות גם אישר ביטוי גבוה יותר באופן משמעותי של DARS-AS1 בגידולים של סרטן אורותל שלפוחית ​​השתן (BLCA), קרצינומה של תאי כליה ותאי כליה ברורים (KIRC), אדנוקרצינומה של הערמונית (PRAD), קרצינומה של תאי קשקש בריאה (LUSC)., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– M) . , קרצינומה של רירית הרחם של הגוף הרחם (UCEC), אדנוקרצינומה של הריאה (LUAD), קרצינומה של הכבד (LIHC), קרצינומה של תאי פפילרי של הכליה (KIRP), ואדנוקרצינומה של המעי הגס (COAD) (ערך p < 0.05) (איור 1e– מ') .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 进一步 证实 了 dars-as1 在 膀胱 尿路 上 皮癌 (blca) 、 肾 肾 透明 细胞癌 (kirc) 、 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌 (lusc) 肿瘤 中 的显着 更 高 表达 ， 子宫体子宫 子宫体子宫 内膜 癌 ≠ ucec） ， 肺腺癌 （luad Å <0.05）（图1e-m） .配 对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌(lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 显着 更 高 表达 ， 内膜 （≠ ucel） （（（（（（（（肾 肾 乳头状 乳头状 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 肾 肾 肾 （癌 （kirp） （coad） （p 值<0.05）（图1e-m） .ניתוח של דגימות מזווגות בריאות/גידולים תמכה עוד יותר בתפקיד של DARS-AS1 בגידולים של סרטן urothelial שלפוחית ​​השתן (BLCA), קרצינומה של תאי כליה צלולים (KIRC), אדנוקרצינומה של הערמונית (PRAD) וקרצינומה של תאי קשקש בריאה (LUSC).экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -M). ביטוי בקרצינומה של קורפוס רחם (UCEC), אדנוקרצינומה של הריאה (LUAD), קרצינומה כבדית (LIHC), קרצינומה של תאי פפילרי כליות (KIRP) ואדנוקרצינומה של המעי הגס (COAD) (ערך p <0.05) (איור 1e -m).יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך ש-DARS-AS1 מתבטא באופן נרחב ומאוד במגוון סוגי סרטן.
מכיוון ש-DARS-AS1 ו-DARS (הגן המקודד לגדיל האנטי-סנס) חולקים את אותו מקדם וממוקמים זה ליד זה, תכננו את ה-shRNA כדי להפיל את DARS-AS1 באופן ספציפי אך לא DARS (איור משלים. 2a,b וטבלה משלימה 2). .בנוסף ל-SW620, השתמשנו גם בשלוש שורות תאים אחרות המבטאות מאוד את DARS-AS1 כדי לחקור את היעילות והתפקוד של נוק-דאון shRNA (טבלה משלימה 3).התוצאות שלנו הצביעו על כך שכל שלושת ה-shRNAs שפותחו השיגו לפחות 80% יעילות DARS-AS1 עם השפעה מועטה על כמות ה-DARS mRNA (איור משלים. 2c-f).בנוסף, מצאנו כי פגיעה ב-DARS-AS1 עם shRNAs אלה עיכבה באופן משמעותי את צמיחת התאים בשורות תאים סרטן המעי הגס SW620 (49.7%) ו-HCT116 (27.7%), שורת תאי סרטן השד MBA-MD-231 (53.4%).) וקו התאים HepG2 hepatoma (ירידה של 92.7%), כמו גם יכולתם ליצור כדורים לא מעוגנים (ירידה ממוצעת של ~50.8%, 44.6%, 40.7% ו-75.7% לכל שורת תאים) (איור 2a,b).ב-SW620, התוצאות של בדיקת יצירת המושבה אישרו עוד כי DARS-AS1 shRNA עיכב באופן משמעותי את התפשטות התאים עם ירידה ממוצעת של כ-69.6% (איור 2c).
השפעת shRNA בקרה ו-DARS-AS1 shRNA על התפשטות תאים (א) ויצירת כדוריות (ב) בתאי SW620, HCT116, MBA-MD-231 ו- HepG2.c השפעת shRNA בקרה ו-DARS-AS1 shRNA על היווצרות מושבה בתאי SW620.התפשטות תאים (ד), היווצרות כדוריות (e) ויצירת מושבה (f) של תאי SW620 המבטאים יתר על המידה DARS-AS1.הנתונים המוצגים הם הממוצע ± סטיית התקן של שלושה ניסויים.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, ו-*** p ≤ 0.001 לפי מבחן t של סטודנט דו-זנבתי.
כדי להשלים מחקרי אובדן תפקוד, יצרנו בשלב הבא תאי SW620 המבטאים יתר על המידה DARS-AS1 (איור משלים. 2g).ביטוי יתר של DARS-AS1 הגביר באופן משמעותי את צמיחת התאים (פי 1.8), היווצרות כדורית לא מעוגנת (פי 1.4) ויצירת מושבה (פי 3.3) בתאי SW620 (איור 2d-f).אישרנו תוצאה זו באמצעות שורת תאים אחרת המבטאת DARS-AS1, A549.התפשטות תאים מוגברת זו עקב ביטוי יתר של DARS-AS1 נצפתה עוד יותר בתאי A549 (איור משלים. 2h, i וטבלה משלימה 3).יחד, מחקרי רווח והפסד אלה מוכיחים ש-DARS-AS1 מקדם שגשוג תאי סרטן במבחנה.
כדי לחקור את המנגנון הבסיסי שבאמצעותו DARS-AS1 מווסת את התפשטות התאים, ביצענו אנליזה של RNA pull-down כדי לזהות את השותפים הפוטנציאליים לקשירת חלבון.תוצאות RT-qPCR הראו שכ-86.2% מ-DARS-AS1 ממוקמים בציטופלזמה של תאי SW620 (איור משלים. 3a).ה-DARS-AS1 או הפסאודו-RNA המתועתקות במבחנה הודגרו לאחר מכן עם lysates של תאים SW620 ואחריו הפרדת SDS-PAGE.צביעת כסף לאחר מכן הראתה כי פס ברור (~38 kDa) מועשר באופן משמעותי בדגימות משיכה של DARS-AS1 אך לא בדגימות דמה של RNA או חרוזים (איור 3א).פס זה זוהה כחלבון מפעיל PKR (PACT) על ידי ספקטרומטריית מסה (MS) ואושר עוד יותר על ידי אימונובלוטינג בקווי תאים SW620, HCT116 ו- HepG2 (איור 3a,b).גם ההעשרה של DARS וחלבוני PACT קשורים - PKR ו-TRBP - נחקרה באמצעות ניתוח RNA על ידי Western blotting (WB).התוצאות הצביעו על כך שלא נמצאה אינטראקציה ישירה בין DARS-AS1 RNA לשלושת החלבונים הללו (איור משלים. 3b).האינטראקציה הספציפית בין DARS-AS1 ו-PACT אושרה עוד יותר על ידי ניתוח RNA immunoprecipitation (RIP), אשר הראה כי DARS-AS1 היה מועשר באופן משמעותי בנוגדנים אנטי-PACT אך לא ב-RNAs בקרה אחרים (איור 3c).כדי לקבוע אם DARS-AS1 יוצר אינטראקציה ישירה עם PACT בהיעדר רכיבים תאיים אחרים, בוצע בדיקת אינטרפרומטריה ביולוגית במבחנה (BLI) באמצעות PACT מטוהר.DARS-AS1 או דמה RNA המסומן ביוטין הושבת על חיישנים ביולוגיים של streptavidin (SA) ולאחר מכן הודגרה במאגר קינטי המכיל 1 מיקרומטר PACT.יש לציין, PACT נקשר חזק ל-DARS-AS1 (ערך KD ~26.9 ננומטר), אך לא לחקות RNA (איור 3ד).ביחד, תוצאות אלו מדגימות אינטראקציה ישירה וזיקה גבוהה בין DARS-AS1 ו- PACT.
ניתוח משיכה של RNA זיהה אינטראקציה של DARS-AS1 עם PACT בתאי SW620.למעלה, צביעת כסף של חלבונים קשורים.אימונובלוטים תחתונים בוצעו עם נוגדן אנטי-PACT.b אנליזה של RNA pull-down בוצעה בתאי HCT116 (עליון) ו-HepG2 (תחתון).העשרת PACT זוהתה על ידי אימונובלוטינג.מבחני cRNA immunoprecipitation (RIP) בוצעו בתאי SW620 באמצעות הנוגדנים המצוינים.d עקומות קישור של PACT ל-DARS-AS1 באורך מלא או ל-RNA בקרה הושגו באמצעות אינטרפרומטריה ביולוגית (BLI).RNA היה משותק על ביוחיישן סטרפטווידין.1 מיקרומטר PACT שימש למדידת אסוציאציה.בדיקת RNA pull e בוצעה באמצעות DARS-AS1 ביוטיניל באורך מלא או קטוע (למעלה).אימונובלוט המציג PACT שהתקבל (למטה).f PACT מסומן מטוהר הודגר עם DARS-AS1 באורך מלא ביוטיניל או קטוע (כמו ב-e) עבור בדיקת RIP חוץ גופית.ה-RNA המופק אומת על ידי RT-qPCR.ז' הזיקה היחסית של שברי RNA שונים ל-PACT התקבלה באמצעות אינטרפרומטריה ביולוגית.לניתוח, נעשה שימוש ב-100 ננומטר RNA ו-1 מיקרומטר RAST.h מבחני RIP במבחנה בוצעו באמצעות PACT מטוהר שלם או קטוע.ה-RNA המופק אומת על ידי RT-qPCR.i קצב גדילה של תאי SW620 המבטאים יתר על המידה DARS-AS1, PACT או שניהם.j לביטוי יתר של DARS-AS1 באורך מלא או קטוע בתאי SW620 היו השפעות שונות על צמיחת התאים.k אפופטוזיס זוהה על ידי אימונובלוטינג עם נוגדן אנטי-PARP.l נוק-אאוט של DARS-AS1 גורם לאפופטוזיס של תאי SW620 כפי שמוצג על ידי ציטומטריית זרימה.הנתונים המוצגים הם הממוצע ± סטיית התקן של שלושה ניסויים. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, לפי מבחן t דו-זנב של תלמיד. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, לפי מבחן t דו-זנב של תלמיד. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 לפי מבחן t של סטודנט דו-זנבתי. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 לפי מבחן t של סטודנט דו-זנבתי.
לאחר מכן יצרנו שלושה שברי RNA DARS-AS1 ביו-טיניל על ידי שעתוק במבחנה כדי לזהות את אזור ה-DARS-AS1 הנדרש לקשר PACT (איור 3ה).תוצאות ניתוח ה-RNA הראו שכל מקטע היה מסוגל לקיים אינטראקציה עם PACT, אך האזור ה-3'-טרמינלי (384-768 נוקלאוטידים המסומנים A3) הראה יותר מ-1-384 נוקלאוטידים המסומנים A1) (איור 3e).תוצאות דומות נצפו במבחן RIP in vitro באמצעות PACT רקומביננטי (איור 3f).בהתאם לתוצאות אלו, ניסויים לקשירת שברי RNA משוקעים ל-PACT באמצעות BLI הראו גם של-PACT יש זיקה גבוהה יותר ל-A3 (384-768 nt) (ערך KD של כ-94.6 nM), בעוד שכמעט אין קישורים לאזורים אחרים.(איור 3ד).
בדקנו גם את אזורי הקישור הקשורים ב-PACT.PACT מכיל שלושה תחומים פונקציונליים, שניים מהם הם דומיינים קושרי RNA דו-גדיליים (dsRBD) ותחום שלישי (המוגדר D3) שפועל כמפעיל של אינטראקציות חלבון.כדי לבחון את יכולת הקישור ל-lncRNA של כל תחום, הנדסנו שלוש מוטציות שהסירו כל אחד משלושת התחומים וביצענו בדיקת RIP במבחנה.התוצאות שלנו הראו שמחיקה של התחום השלישי (D3) של PACT הפחיתה משמעותית את האינטראקציה שלו עם DARS-AS1 (פי 0.11 בהשוואה ל-PACT שלם) בהשוואה לשתי המוטציות האחרות (איור 3h), הוכח שהשחרור של D3 קיים אינטראקציה עם DARS.-AC1.ביחד, תוצאות אלו מצביעות על כך שאינטראקציה בין DARS-AS1 ו-PACT עשויה להתרחש בעיקר דרך קצה 3' של DARS-AS1 ותחום D3 של PACT.
ציינו כי ל-DARS-AS1 לא הייתה השפעה על ביטוי PACT ול-PACT לא הייתה השפעה על DARS-AS1 (איור משלים. 3c).לאחר מכן בדקנו את ההשפעה של נוק-דאון PACT על צמיחת תאים.בניגוד ל-DARS-AS1, תאים יחסיים גדלו פי 1.5-3 מהר יותר כאשר PACT הופל (איור משלים. 3d).תוצאות בדיקת יצירת המושבה הצביעו על כך שהתאים יצרו מושבות פי 2-3 לאחר טיפול shRNA עם PACT (איור משלים. 3e).כדי לבדוק אם DARS-AS1 מווסת את התפשטות התאים באמצעות PACT, יצרנו תאי SW620 המבטאים יתר על המידה PACT, DARS-AS1 או שניהם.ביטוי יתר של PACT הראה עיכוב משמעותי של שגשוג תאים (איור 3i).בעוד שביטוי יתר של DARS-AS1 כשלעצמו מקדם באופן משמעותי את התפשטות התאים, לא היה הבדל משמעותי בקצב הגדילה של תאים המבטאים עודף DARS-AS1 ו-PACT.תוצאות אלו מצביעות על כך ש-PACT עשוי לנטרל את ההתפשטות המוגברת הנגרמת על ידי ביטוי יתר של DARS-AS1.
מאחר לאזורים שונים של DARS-AS1 יש יכולות שונות של קישור PACT, חקרנו את השפעתם היחסית על התפשטות תאים על ידי ביטוי יתר שונה של שברי DARS-AS1.בהשוואה לשני המקטעים האחרים, DARS-AS1 הובע יתר על המידה בקצה 3' (384-768 nt), האזור העיקרי הקשור ל-PACT ב-DARS-AS1, בעל היכולת הגבוהה ביותר לעורר שגשוג תאים (איור 3j).תוצאות אלו מצביעות על מתאם חיובי בין יכולת הקישור לתפקוד הביולוגי של DARS-AS1.
דווח כי PACT הוא חלבון פרו-אפופטוטי19.לכן, חקרנו את ההשפעה של DARS-AS1 על אפופטוזיס.כצפוי, נוק-דאון DARS-AS1 הגביר באופן משמעותי את מחשוף PARP בתאי SW620 והגדיל את שיעור התאים החיוביים ל-Annexin V בקווי תאים SW620, HCT116, HepG2 ו-MBA-MD-231 (איור 3k).3).3f-h), המצביע על כך שהאפקט האנטי-אפופטוטי של DARS-AS1 בתאי סרטן הפוכה לתפקוד מעורר האפופטוזיס של PACT.יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך שהמנגנון של תפקוד אונקוגני DARS-AS1 עשוי להיות דרך עיכוב של תפקוד PACT.
לאחר מכן, חקרנו את ההשלכות התפקודיות של האגודה DARS-AS1-PACT.דווח כי PACT מפעיל את PKR באמצעות אינטראקציה ישירה, אשר לאחר מכן משפרת את זרחון eIF2α, וגורמת למחיקה תרגום ואפופטוזיס17.ראשית, בדקנו האם DARS-AS1 משפיע על הלוקליזציה הסלולרית של PACT ו-PKR.מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית הראתה ש-PACT ו-PKR היו מאוד משותפים בתאי SW620 עם מקדם מתאם ממוצע של פירסון של 0.72.בינתיים, ביטוי יתר של DARS-AS1 הפחית באופן משמעותי את שיתוף ה-PACT ו-PKR (מקדם מתאם ממוצע של פירסון 0.61) (איור 4א).כדי לחקור אם DARS-AS1 יכול לווסת את האינטראקציה של PACT-PKR, ביצענו מבחן שיתוף אימוני (co-IP) עם נוגדן אנטי-PACT בליזטים של תאי SW620.PKR היה מועשר מאוד באנטי-PACT בתאי בקרה, בעוד שהחלמת PKR הופחתה באופן משמעותי ב-lysates מתאי ביטוי יתר של DARS-AS1 (איור 4b).PACT ו-PKR מטוהרים שימשו עבור מבחני קשירת חלבון במבחנה.בהתאם, אלה שסיפקו DARS-AS1 אך ללא RNA בקרה הראו אינטראקציה מדוכאת של PACT-PKR (איור 4c).כל התוצאות הראו ש-DARS-AS1 שיבש את תקשורת PACT ו-PKR.
נצפתה לוקליזציה משותפת של PACT ו-PKR בתאי בקרה או תאים המבטאים יתר על המידה DARS-AS1 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקאלי.הגרעינים נצבעו ב-DAPI.תוצאות סטטיסטיות התקבלו מ-16 תצלומים.b Co-immunoprecipitation (co-IP) באמצעות נוגדן אנטי-PACT בליזטים של תאים של תאי SW620 בקרה או תאים המבטאים יתר על המידה DARS-AS1.c שכותרתו PACT, PKR מטוהרת ותעתוק במבחנה עם DARS-AS1 או RNA מדומה הודגרה לניתוח קישור חלבון במבחנה.נוגדנים נגד דגל שימשו עבור משקעים חיסוניים.d אימונובלוטים עם הנוגדנים המצוינים בוצעו בתאי SW620 ו- HCT116 שהועברו ב-control shRNA או DARS-AS1-shRNA ואחריו הרעבה בסרום.רמות ביטוי DARS-AS1 שינו את הרגישות התאית ל-thapsigargin.תאי SW620 הועברו transfected עם DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 פלסמיד ביטוי יתר או פלסמיד בקרה.תאים טופלו עם thapsigargin במשך 48 שעות וכדאיות התא נקבעה באמצעות מגיב MTS.f במבחנה מתומלל DARS-AS1 או דמה RNA ו-PACT מטוהר שימשו לבדיקת הפעלה חוץ גופית וזיהוי אימונובלוט.g Immunoblots באמצעות נוגדנים אלה בוצעו על תאי SW620-ctrl (משמאל) או תאים המבטאים יתר על המטאנטים PKR (מימין).תאים אלה הועברו לאחר מכן עם shRNA בקרה או DARS-AS1-shRNA ואחריו הרעבה בסרום.h ציטומטריית זרימה הראתה כי אי-אקטיבציה של המוטנטי PKR פיצה על אפופטוזיס המושרה על ידי DARS-AS1 בתאי SW620.i Immunoblots עם הנוגדנים המצוינים בוצעו בתאי SW620 (משמאל) או HCT116 (מימין).תאים שהועברו ב-shRNA בקרה או DARS-AS1 shRNA נטולי סרום ומוסיפים להם מעכב PKR C16 או DMSO של 100 ננומטר.סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר.הנתונים המוצגים הם הממוצע ± סטיית התקן של שלושה ניסויים.* p ≤ 0.05 מבחן t של תלמיד דו-זנב.
נהוג להאמין שברגע ש-PACT יוצר אינטראקציה עם PKR17, ניתן לגרום ל-PKR זרחון ב-Thr451.התוצאות שלנו הצביעו על כך שרמת הזרחון PKR עלתה משמעותית בתאי נוק-דאון DARS-AS1 לאחר הרעבה בסרום (איור 4ד ואיור משלים 4a).בהתאם לכך, מצאנו שהזרחון של eIF2α, מצע ה-PKR הראשי, גדל גם הוא באופן משמעותי על ידי DARS-AS1 shRNA (איור 4ד ואיור משלים 4a).Thapsigargin הוא גורם דחק ER שגורם ל-ER לשחרר Ca2+.דווח על טיפול ב-thapsigargin כגורם לביטוי והפעלה של PACT, אשר מקיים אינטראקציה נוספת עם PKR ומפעילה, מה שמוביל לאפופטוזיס על ידי הגברת זרחון eIF2α 18,61.כאן, השתמשנו ב-thapsigargin כממריץ של מסלול PACT/PKR כדי לחקור האם DARS-AS1 יכול לעזור לתאים להתגבר על מתח על ידי עיכוב מסלול PACT/PKR.ראינו שרמת הביטוי DARS-AS1 נמצאת בקורלציה חיובית עם עמידות התא ל-thapsigargin.תאי SW620 המבטאים יתר על המידה DARS-AS1 שרדו טוב יותר כאשר טופלו ב-thapsigargin, בעוד תאים עם DARS-AS1 נוק-דאון הפכו לרגישים יותר (איור 4ה).בהתאם לתוצאות אלו, ביטוי יתר של DARS-AS1 הפחית את זרחון PKR המושרה על ידי thapsigargin (איור משלים. 4b).לעומת זאת, לאחר טיפול ב-thapsigargin, PKR ו-eIF2α זרחנו במידה גבוהה יותר בתאי נוק-דאון DARS-AS1 בהשוואה לתאי בקרה (איור משלים. 4b).מעניין לציין ש-thapsigargin גרמה לביטוי DARS-AS1 באופן תלוי מינון, מה שעשוי להצביע על פונקציה אנטי-סטרס של DARS-AS1 (איור משלים. 4c).בנוסף, ביצענו מבחני הפעלה במבחנה כדי לאשר את התצפיות הללו.בקצרה, PKR טוהר מ-lysates של תאים באמצעות נוגדן אנטי-PKR, ולאחר מכן הודגר עם PACT רקומביננטי ו-DARS-AS1 שתועתק במבחנה.לאחר התגובה האנזימטית, זוהה פוספו-PKR באמצעות WB.התוצאות שלנו הצביעו על כך שזרחון PKR עוכב באופן משמעותי על ידי DARS-AS1, אך לא על ידי RNA בקרה (איור 4ו).תוצאות אלו במבחנה ובאינבו מצביעות על כך ש-DARS-AS1 מעכב הפעלת PKR בתיווך PACT.במקביל, ראינו גם ירידה בהתאוששות PACT בנוכחות DARS-AS1 (איור 4ו).תוצאה זו עולה בקנה אחד עם התוצאות של מבחן קשירת חלבון במבחנה (איור 4c) ושוב ממחישה את תפקוד החסימה של DARS-AS1 עבור קשר PACT-PKR.
Ser246 ו-Ser287 בתחום D3 של PACT נדרשים להפעלת PKR תחת לחץ תאי.החלפה של שני שרידי סרין לאלנין נתנה PACT מוטנטי (mutD), שהפעיל PKR בהיעדר לחץ, והחלפה באלנין (mutA) הפכה את הפרוטוקול.מכיוון שהדגמנו את החשיבות של תחום זה בקשר ישיר עם DARS-AS1, יצרנו את שני המוטנטים של PACT כדי לבדוק אם שאריות אלו יכולות להיות מעורבות גם באינטראקציה עם DARS-AS1.מעניין ששני המוטנטים איבדו את היכולת להיקשר ל-DARS-AS1 (איור משלים. 4d), מה שמרמז על כך שהמבנה השלם של חלבון PACT עשוי להידרש לאינטראקציה יעילה עם DARS-AS1.
יתר על כן, התוצאות שלנו מצביעות גם על כך שניתן לשחזר באופן חלקי עיכוב של שגשוג תאים המושרה על ידי DARS-AS1-shRNA על ידי ביטוי יתר של מוטנט PACT שלילי דומיננטי (PACTmutA) או מוטנט PKR שלילי דומיננטי (PKRmut) (איור משלים. 4e. ה).ביטוי יתר של מוטנטים דומיננטיים-שליליים של PKR הפחית את זרחון PKR המושרה על ידי נוק-דאון DARS-AS1 וכן זרחון eIF2α בתאים חסרי סרום (איור 4g).חשוב מכך, חלקם של תאים אפופטוטיים המושרים על ידי פגיעה ב-DARS-AS1 הופחת גם בתאים המבטאים יתר על המידה PKRmut (איור 4h ואיור משלים 4g).עיכוב פעילות PKR קינאז פוגע גם בתפקוד DARS-AS1, שכן תוצאות הראו ש-DARS-AS1 נוק-דאון רק לעתים נדירות עורר זרחון PKR ו-eIF2α כאשר תאים טופלו במעכבי C16 ספציפי ל-PKR (איור 4i ואיור משלים 4h).).ביחד, התוצאות שלנו מצביעות על כך ש-DARS-AS1 מקדם שגשוג תאים, לפחות בחלקו, על ידי עיכוב הפעלת PKR בתיווך PACT.
כדי להמשיך ולחקור את התפקיד של DARS-AS1 בגידול הגידול, ביצענו ניסויים in vivo באמצעות מודל xenograft של עכבר. התוצאות מראות כי נפילה של DARS-AS1 הפחיתה באופן דרמטי את צמיחת הגידול בעכברים (ערך p < 0.0001) (איור 5a). התוצאות מראות כי נפילה של DARS-AS1 הפחיתה באופן דרמטי את צמיחת הגידול בעכברים (ערך p < 0.0001) (איור 5a). תוצאות התקדמות, לאחר התקדמות DARS-AS1 ניתנות לאופטימיזציה עבור החברה (מחיר ממוצע של <0,0001) (500 שקלים). התוצאות מראות שדפיקת DARS-AS1 מפחיתה באופן דרסטי את צמיחת הגידול בעכברים (ערך p < 0.0001) (איור 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（囀5a）结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a） מקורות מידע, מנה של DARS-AS1 זמינות עבור אופציה לשוק (מחיר <0,0001) (5). התוצאות הראו כי נפילת DARS-AS1 הפחיתה באופן משמעותי את צמיחת הגידול בעכברים (ערך p < 0.0001) (איור 5a).לפיכך, בקבוצת ה-DARS-AS1 נוק-דאון, הייתה ירידה משמעותית בנפח הגידול הממוצע בכ-72.9% ובמסת הגידול הממוצעת בכ-87.8% (איור 5b-d).תוצאות אלו מצביעות על כך ש-DARS-AS1 יכול לקדם באופן משמעותי את צמיחת הגידול in vivo.
השפעות של דפיקת פרסום DARS-AS1 על אונקוגנזה של המעי הגס בעכברים עירומים.מוצגות עקומות גדילה (א), גודל הגידול (ב), משקל (ג) ותמונות גידול (ד).פסי שגיאה מייצגים ±SEM. n = 10. ****p < 0.0001, לפי מבחן t דו-זנב של תלמיד. n = 10. ****p < 0.0001, לפי מבחן t דו-זנב של תלמיד. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0.0001 מבחן t של תלמיד דו-זנב.n = 10. ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验. ****p < 0.0001，通过双尾学生t检验. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0.0001 מבחן t של תלמיד דו-זנב.e Kaplan-Meier ניתח את המתאם בין רמות ביטוי DARS-AS1 והישרדות כוללת בחולים עם UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM ו-LGG.רמות גבוהות של ביטוי DARS-AS1 בחולים היו ב-50% העליונים;הרמה הנמוכה של ביטוי DARS-AS1 בחולים הייתה ב-50% התחתונים.ערכי p נקבעו באמצעות מבחן דירוג היומן.f מודל מוצע שבו DARS-AS1 מווסת את מסלול PACT-PKR וצמיחת הגידול.
כדי להבין טוב יותר את ההשפעה הקלינית של DARS-AS1, בדקנו את המתאם בין הביטוי שלו להישרדות החולה.על ידי ניתוח מערך הנתונים של TCGA, מצאנו כי ביטוי גבוה יותר של DARS-AS1 היה קשור למלנומה עורפית (UVM), כרומופוביה כלייתית (KICH), קרצינומה של תאי כליות פפילריים (KIRP), מזותליומה (MESO), מולטיפלקס.הישרדות נמוכה יותר הייתה קשורה באופן מובהק ל- glioblastoma morphosis (GBM) ולמטופלים עם גליומה מוחית בדרגה נמוכה (LGG) (איור 5e).תוצאות אלו מצביעות על כך ש-DARS-AS1 עשוי למלא תפקיד חשוב בהתקדמות הגידול הקליני ויכול להיות סמן ביולוגי פוטנציאלי לחיזוי במספר סוגי סרטן.
במחקר זה, תוך שימוש בסריקה תפקודית בקנה מידה גדול של CRISPRi, קבענו ש-DARS-AS1 lncRNA מתגבר על מתח תאי סרטן על ידי ויסות שני מגיבים מרכזיים ללחץ, PACT ו-PKR.על ידי אינטראקציה ישירה עם PACT, DARS-AS1 עיכב את הפעלת PKR בתיווך PACT, ובכך מנע מוות של תאים אפופטוטיים וקידום שגשוג תאים (איור 5f).שיפור ויסות של DARS-AS1 נצפתה במספר סוגים של סרטן, מה שמצביע על כך שתפקידו לקדם הישרדות תאי סרטן בתנאי לחץ עשוי להיות ישים באופן נרחב לסוגים מרובים של סרטן.
PACT זוהה כחלבון מפעיל PKR, והפעלת PKR בתיווך PACT משחקת תפקיד חשוב בתגובות לחץ על ידי ויסות שעתוק, תרגום, אפופטוזיס ותהליכים תאיים חשובים אחרים62.במשך עשרות שנים, נעשו ניסיונות להבין את הרגולציה הספציפית לסרטן של מפל PACT-PKR.כאן, המחקר שלנו חשף מנגנון שונה של ויסות של PACT-PKR בתאי סרטן באמצעות lncRNA DARS-AS1 תאי, הנקשר ישירות ל-PACT, חוסם אינטראקציה של PACT-PKR, מעכב הפעלת PKR וזרחון eIF2α, ובכך מעכב אפופטוזיס הנגרמת על ידי מתח ו גירוי בסופו של דבר התפשטות סרטן.תאים.תגלית זו שופכת אור על יעדי lncRNA פוטנציאליים לפרוגנוזה וטיפול בסרטן.
הנתונים שלנו הראו ש-DARS-AS1 נוק-דאון גורם לרגישות לתאים להרעבה בסרום עם עלייה משמעותית ב-PKR מזורחן וב-eIF2α.תוצאות אלו מצביעות על כך ש-DARS-AS1 מקדם הישרדות תאי סרטן בתנאים קשים על ידי עיכוב פעילות PACT/PKR.מספר RNAs אחרים שאינם מקודדים, כגון ASPACT ו-nc886, מעורבים גם הם בציר PACT/PKR על ידי הורדת ויסות ה-MRNA של PACT48 או ויסות אוטופוספורילציה על ידי קישור ל-PKR49,50,64.ביניהם, DARS-AS1 פועל כמשבש של עמותת PACT-PKR.מחקר זה מעשיר את ההבנה שלנו לגבי ויסות ציר PACT/PKR והתפקיד של lncRNAs בתגובות לחץ.
PACT מכיל שלושה תחומים נפרדים.כל אחד משני ה-dsRBDs הראשונים מספיק כדי להשיג קשירה בעלת זיקה גבוהה של PACT ל-PKR, בעוד שהתחום השלישי (D3) נדרש להפעלת PKR in vitro ו-in vivo.המחקר שלנו הראה ש-DARS-AS1 מקיים אינטראקציה מועדפת עם תחום D3 (איור 3h).בהתחשב בגודל הגדול של ה-lncRNA (768 נוקלאוטידים), קישור DARS-AS1 ל-D3 יכול לעכב פיזית את האינטראקציה בין תחום ה-PACT של dsRBD ו-PKR, ובכך לחסום את הקשר של PACT ו-PKR.מוטציות נקודתיות של PACT שהחליפו את Ser246 ו-Ser287 ב-D3 באלנין או אספרטאט שיבשו את הזיקה המחייבת שלו ל-DARS-AS1, והצביעו על החשיבות של התכונות המבניות והחשמליות הכוללות של D3 בקשר ביניהם.פרטים נוספים על מנגנון זה יידרשו בעתיד, תוך שימוש בניתוח ביוכימי מדויק יותר וניתוח מבני PACT ברזולוציה גבוהה.
מחקרים קודמים דיווחו כי DARS-AS1 מקדם שגשוג תאים באמצעות מספר מנגנונים51,52,53.בדוגמה אחת, החוקרים הבחינו ש-DARS-AS1 העלה ויסות של גן DARS המקודד לחלבון אנטי-סנס על ידי מיקוד ל-miP-194-5p בתאי סרטן הכליה.עם זאת, במחקר הנוכחי, לדפוק של DARS-AS1 הייתה השפעה מועטה על שעתוק DARS במספר סוגים של סרטן, כולל לפחות סרטן המעי הגס, השד והכבד.מכיוון ש-lncRNAs מציגים דפוסי ביטוי ספציפיים לתאים ולרקמות, ייתכן שמנגנונים תפקודיים לא יישמרו על פני סוגי סרטן, מה שעשוי לתרום לאי-התאמה בין התצפיות שלנו לבין הערכות קודמות של סוגי סרטן שונים.יש צורך במחקרים מיוחדים כדי להבהיר את המנגנונים הספציפיים של תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים.
ניתוח של נתונים קליניים הראה שביטוי DARS-AS1 בגידולים נמצא בקורלציה הפוכה להישרדות חולי סרטן, מה שמדגיש את החשיבות של ציר DARS-AS1/PACT/PKR בפרוגנוזה של סרטן.לסיכום, המחקר שלנו מראה ש-DARS-AS1 הוא מווסת של ציר האיתות PACT/PKR, מקדם שגשוג תאי סרטן ומעכב אפופטוזיס במהלך תגובת הלחץ, מה שמספק קו מחקר נוסף ומעניין למחקר עתידי של טיפולים פוטנציאליים .
קווי תאים אנושיים SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 ו-HEK293T הושגו מתשתית המשאבים הלאומית של קו התא בסין.כל התאים נשמרו במדיום DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) בתוספת 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (Thermo Fisher Scientific) ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.מַדגֵרָה.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);אנטי-דגל, אבקם (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (זרחן S51), Abcam (ab32157);אנטי-PACT (זרחן S246), אבגנט (AP7744b);anti-β-tubulin, CST (2128);עכבר רגיל IgG, CST (5415S);ארנב רגיל IgG, CST (2729S).נוגדנים הודללו 1:1000 ב-PBST עבור Western blotting ו-1:100 עבור IP.
sgRNAs פותחו באמצעות כלי זמין לציבור בשם CRISPR-ERA66.השתמשנו בפרמטרים של כלי ברירת המחדל לפיתוח sgRNA והאלגוריתם חישב אתרי הקישור של sgRNA באזור ה-3 kb.מרוכז ב-TSS.בריכות של אוליגונוקלאוטידים של sgRNA סונתזו ב- CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) ושובטו לפלסמידים של pgRNA מואנשים (Addgene #44248).סך של 12 מיקרוגרם של פלסמיד pgRNA הומני מאוחד, 7.2 מיקרוגרם של psPAX2 (Addgene #12260), ו-4.8 מיקרוגרם של pMD2.G (Addgene #12259) הועברו יחד ל-5 x 106 HEK293T באמצעות צלחות של DNA Transection 10 תאים (CWBIO, בייג'ינג, סין) בהתאם להוראות היצרן.סופרנטנטים המכילים וירוסים נאספו 48 ו-72 שעות לאחר ההעברה וסוננו דרך מסנן 0.45 מיקרומטר.להקרנה, תאי SW620 המבטאים את חלבון ההיתוך dCas9/KRAB התקבלו על ידי התמרה של וירוסים.תאי SW620 שעברו שינוי הודבקו בספריית הנגיפים בארבעה ניסויי זיהום עצמאיים ב-MOI של 0.1-0.3 ונדגמו עם 2 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין (Sigma, St. Louis, MO) למשך יומיים.לאחר מכן, תאים תורבו במשך 18 ימים במבחנה עם כיסוי ספרייה מינימלי של 500 תאים/sgRNA להקרנה.
DNA גנומי הופץ בהתאם להוראות של QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, דיסלדורף, גרמניה; 51183).בסך הכל, 100 מיקרוגרם של DNA גנומי לכל חזרה ביולוגית שימשו לבניית הספרייה.אזור ה-sgRNA הוגבר על ידי שני סבבים של PCR ונקשר לברקוד.
מוצרי PCR טוהרו באמצעות NucleoSpin® ג'ל וערכת טיהור PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, גרמניה; 740609.250) וכומתו באמצעות ערכת זיהוי דו-גדילי של Qubit™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
בדיקת MTS שימשה למדידת שגשוג תאים.תאים נזרעו בצלחות 96-בארות בצפיפות ראשונית של 2000 תאים/באר.המספר היחסי של התאים נמדד מדי יום בזמן המצוין במשך 4-6 ימים בסך הכל.עבור כל באר, 20 μl מגיב MTS (Promega) הודללו ב-100 μl של DMEM, הודגרו עם תאים למשך 4 שעות ב-37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן נמדד OD490.
היכולת לצמיחה לא מעוגנת התגלתה על ידי ניתוח היווצרות כדורים.בקצרה, 2000 תאים שהועברו עם shRNA DARS-AS1 או בקרה shRNA תורבו במיקרו-צלחות נמוכות במיוחד (Corning) עם שינוי בינוני כל 4 ימים.הכדוריות נספרו לאחר 14 ימים.500 תאים שהועברו עם פלסמיד ביטוי יתר DARS-AS1 או פלסמיד בקרה שימשו למבחן השיפור, אחרת השיטה לא השתנתה.
RNA הועתק באמצעות T7 RNA פולימראז וביוטין-16-UTP (Roche 1138908910) לפי ההוראות של Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).הפריימרים המשמשים כאן מפורטים בטבלה משלימה 4.
אזורי PACT או PKR מקודדי חלבון שובטו לתוך pET15b (Addgene #73619) והומרו ל-BL21(DE3).החיידקים הודגרו למשך הלילה ב-LB שסופק עם אמפיצילין ולאחר מכן הודללו פי 100 עם LB טרי.כאשר ה-OD600 של המדיום הגיע ל-0.8, נוספו 1 mM IPTG כדי לגרום לביטוי חלבון.לאחר דגירה למשך הלילה עם ניעור עדין (250 סל"ד ב-20 מעלות צלזיוס), גלולת התא נאספה בצנטריפוגה (4000 סל"ד, 10 דקות, 4 מעלות צלזיוס).השהה מחדש את גלולת התא במאגר תמוגה (50 מ"מ Tris, pH 8.0, 250 מ"מ NaCl, 1 מ"מ PMSF) ודגירה על קרח למשך 30 דקות, ולאחר מכן בצע קול (15 דקות, 5 שניות הפעלה/כיבוי, על קרח) וצנטריפוגה (13,000 סל"ד)., 30 דקות, 4°C).לאחר מכן הועלה הסופרנטנט על שרף Ni-NTA (QIAGEN) 3 פעמים ב-4 מעלות צלזיוס, נשטף 4 פעמים עם חיץ כביסה (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM imidazole, 250 mM NaCl) ונשלף 3 פעמים, עם סך כולל של חיץ eluent 10 מ"ל (50 מ"מ Tris, pH 8.0, 250 מ"מ NaCl, 300 מ"מ אימידאזול).חלבון מטוהר נקבע באמצעות WB והריכוז נקבע באמצעות ערכת בדיקת החלבון Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
מבחני RIP בוצעו כמתואר קודם, עם שינויים.בקצרה, 1x חיץ RIP (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin ribonuclease inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, פרוטאז) מפיץ קוקטייל ציטוסטטי 1 x 107 (Roche, 1 mM DTT) וצנטריפוגה ב-13,000 סל"ד למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.לאחר מכן הודגר הסופרנטנט עם חלבון A+G חרוזים מגנטיים (Millipore) מצומדים עם 5 מיקרוגרם של נוגדן אנטי-PACT (Abeam) או IgG (CST).החרוזים נשטפו 5 פעמים עם חיץ 5x RIP, ואז עוכלו עם פרוטאינז K (NEB).RNA חולץ עם Trizol ונקבע על ידי RT-qPCR.פריימרים מוצגים בטבלה משלימה 5.
בדיקת RIP במבחנה בוצעה על פי פרוטוקול בדיקת RIP סטנדרטי שונה.סך של 5 pmol של RNA מתומלל במבחנה היה מדולל 1x עם חיץ RIP וחוזר על ידי דגירה ב-65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן קירור איטי לטמפרטורת החדר.סך של 5 pmol של חלבוני PACT שלמים או שעברו מוטציה טוהר מ-E. coli.דגירה עם RNA משוחזר למשך שעתיים ב-4 מעלות צלזיוס ופעל לפי ההליך לעיל לניתוח RIP עבור IP נגד דגל.
עבור ניתוח הארכת RNA, 1×107 תאים עברו lysed עם חיץ 1xRIP.לאחר צנטריפוגה ב-13,000 סל"ד למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, הסופרנטנט טופל מראש ב-30 μl של חרוזים מגנטיים של streptavidin (בקמן) למשך 2 שעות ב-4 מעלות צלזיוס.לאחר מכן סופקו לליזאט המטוהר tRNA שמרים והודגרה עם 40 pmol של RNA משוחזר למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן במשך שעתיים נוספות ונוספו 20 μl של חרוזים מגנטיים חדשים של streptavidin חסומים ב-BSA.שלב הכביסה כלל 4 פעמים עם חיץ RIP 5x ו-4 פעמים עם חיץ RIP 1x.החלבונים התואמים נפלטו עם חיץ elution ביוטין (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotin, PMSF) והופרדו על NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).לאחר צביעת כסף (ביוטים ביוטכנולוגיה), רצועות מסוימות נכרתו ונותחו על ידי טרשת נפוצה.
ניתוח Co-IP בוצע כדי לבדוק את האינטראקציה בין PACT ל-PKR.בקצרה, lysates supernatant הוכנו על ידי דגירה של 1 x 107 תאים lysed במאגר 1 x RIP ואחריו צנטריפוגה ב-13,000 סל"ד למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.הליסאטים הועמסו בחרוזים מגנטיים של חלבון A + G, מצומדים עם 5 מיקרוגרם של נוגדן אנטי-PACT, ומסתובבים בעדינות במשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.החרוזים נשטפו 3 פעמים עם חיץ 5×RIP, פעמיים עם חיץ 1×RIP ונפלטו עם חיץ 1×SDS.החלבון המשוחזר נותח על ידי ג'ל SDS-PAGE וזוהה על ידי WB.
שני pmol של PACT מסומן ו-1 pmol של PKR טוהרו מ-E. coli.דלל במאגר 1× RIP ודגירה עם 10 pmol של RNA משוחזר למשך שעתיים ב-4 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, הם הודגרו עם נוגדן אנטי מסומן עם חרוז מגנטי חלבון A+G למשך שעתיים נוספות.לאחר מכן, החרוזים נשטפו ארבע פעמים עם חיץ RIP 1x ונפלטו עם חיץ 1x SDS.ה-PACT וה-PKR שהתקבלו זוהו על ידי WB.